口蹄疫病毒荧光RT—PCR检测试剂盒的筛选

凌洪权 黎朝燕 杨泽林 谢建华 董春霞 黄恒 钟小艳 吴昌义

摘要：为了及时、准确地诊断口蹄疫疫情，避免误诊而造成重大的经济损失，我们对5个不同生物技术有限公司（分别以A、B、C、D、E代替）生产的口蹄疫病毒通用型、O型、A型、Asia1型荧光RT-PCR检测试剂盒进行了试验对比，最终从通用型和3个分型试剂盒的灵敏性、交叉反应、反应体系、反应条件、反应速度、操作简便性等方面筛选出了B公司的试剂盒相对优于其他4个公司的试剂盒。

关键词：口蹄疫；试剂盒；筛选

中图分类号：S852.65 文献标识码：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2018.04.004

口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）属于微RNA病毒科（Picornaviridae）、口蹄疫病毒属（Aphthovirus）的单股正链RNA病毒，含有7个型（O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2、SAT3）和多种亚型[1]。能够感染多种偶蹄动物，造成严重的经济、政治和社会问题[2-3]。在我国以及非洲和亚洲的许多国家流行，其传播速度快、感染率高，严重影响当地畜牧业的发展以及动物产品的国际贸易[4-5]。该病被世界动物卫生组织（OIE）列为必须通报的动物疫病，也是我国一旦发生必须上报的一类动物传染病之首[6]。本试验通过对5个生物技术有限公司提供的口蹄疫病毒试剂盒进行比较，旨在为及时、准确地处理口蹄疫疫情提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 抗原

口蹄疫病毒A型抗原、O型抗原、Asia1型抗原购自国家口蹄疫参考实验室中国农业科学院兰州兽医研究所。

1.2 试剂

口蹄疫病毒通用型荧光RT-PCR检测试剂盒、口蹄疫病毒O型荧光RT-PCR检测试剂盒、口蹄疫病毒A型荧光RT-PCR检测试剂盒、口蹄疫病毒Asia1型荧光RT-PCR检测试剂盒购自 A、B、C、D、E 5个公司。

1.3 核酸提取试剂盒

核酸提取试剂盒（磁珠法）购自天隆科技生物技术有限公司。

1.4 方法

依据《口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法》GB/T 22915-2008。

2 结果

2.1 口蹄疫病毒通用型荧光RT-PCR试剂盒检测结果表（见表1）

2.2 口蹄疫病毒O型荧光RT-PCR试剂盒检测结果表（见表2）

2.3 口蹄疫病毒A型荧光RT-PCR试剂盒检测结果表（见表3）

2.4 口蹄疫病毒Asia1型熒光RT-PCR试剂盒检测结果表（见表4）

2.5 口蹄疫病毒通用型、O型、A型、Asia1型荧光RT-PCR试剂盒结果评比表（见表5）

评分和灵敏性指标：

操作简便性：配制反应体系时，几种同类试剂盒比较，最便捷得3分，中等得2分，最差得1分。

反应体系一致性：每个公司4种试剂盒配制体系时各个成分的量完全一致得3分，3种一致或2、2一致得2分，只有2种一致得1分，全都不一致得0分。

反应条件一致性：通用型与3种分型试剂盒的反应条件完全一致得3分，3种一致或2、2一致得2分，只有2种一致得1分，全都不一致得0分。

交叉反应：无交叉反应且增长趋势好者得3分、增长趋势一般者得2分、增长趋势平缓者得1分；有交叉反应者得0分。

灵敏性：首先淘汰有交叉反应者，再根据CT值与平均值比较，CT值越小或越接近平均值且增长趋势越好者灵敏性越高。

经过对5个公司口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测试剂盒的比较，筛选出B公司的试剂盒相对于其他4个公司的试剂盒操作简便、通用型与3个分型能在同一台荧光PCR仪上同时完成（即反应条件一样）、各个分型试剂盒无交叉反应、灵敏性较高等优势，因此B公司的试剂盒是首选。

3 讨论

口蹄疫诊断技术包括口蹄疫病毒的微量补体结合试验、食道探杯查毒试验、反转录一聚合酶链反应（RT-PCR），病毒中和试验、液相阻断一酶联免疫吸附试验、病毒感染相关抗原（VIA）琼脂凝胶免疫扩散（AGID）试验（适用于检测各种不同样品中的口蹄疫病毒抗原或抗体）[7]以及口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法（适用于动物及其动物产品中口蹄疫病毒的检测）[8]。确诊口蹄疫疫情时，一般都是检测样品中是否含有口蹄疫病毒，因此RT-PCR或荧光RT-PCR方法较为常用。RT-PCR方法相对比荧光RT-PCR方法较为复杂、耗时也长，所以荧光RT-PCR方法是确诊疫情的首先方法。

由于口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测试剂盒有诸多的优特点，因此市场上荧光检测试剂盒犹如春笋般的涌现出来，生产厂家较多，但是检测效果各异。为了准确地诊断疫病，在选用不同公司的试剂盒之前一定要做试验比较，不能盲目地根据价格的高低而轻易选购，否则误诊会造成更大的经济损失。

参考文献

[1] 刘庆军，张永光.口蹄疫病毒基因组结构及其功能[J].动物医学进展，2005， 26（5）：1-5.

[2] Thomson G R， Vosloo W， Bastos A D S.Foot and mouth disease in wildlife [J].Virus Research，2003，91（1）：145-161.

[3] Grubman M J， Baxt B.Foot-and-mouth disease.[J].British Journal of General Practice the Journal of the Royal College of General Practitioners， 2001， 51（466）：417.

[4] Sobrino F， Domingo E.Foot-and-mouth disease in Europe.FMD is economically the most important disease of farm animals.Its re-emergence in Europe is likely to have consequences that go beyond severe alterations of livestock production and trade.[J].Embo Reports， 2001，2（6）：459-61.

[5] Domingo E，Baranowski E，Escarmís C，et al.Foot-and-mouth disease virus[J].Comparative Immunology Microbiology & Infectious Diseases，2002，25（5-6）：297.

[6] Baxi M K， Baxi S，Clavijo A， et al.Microarray-based detection and typing of foot-and-mouth disease virus.[J].Veterinary Journal，2006，172（3）：473-481.

[7] 王莉娟，徐天刚，赵云玲，等.口蹄疫诊断技术研究进展[J].中国畜牧兽医， 2005，32（3）：41-44.

[8] 罗长保，鱼海琼，林志雄.应用荧光RT—PCR技术检测口蹄疫病毒[J].中国兽医杂志， 2003，39（12）：31.