抗菌肽对烟草青枯菌的抑菌作用

江仕龙 刘明宏 高亚星 蒋选利

摘 要：烟草青枯病是烟草生产上的主要病害之一，安全、有效的防治烟草青枯病对烟草生产具有重要的现实意义。为了解决烟草青枯病的防治这一难题，设计了5种人工合成的多肽和寡肽，采用抑菌圈测定法测定其对青枯菌的抑制效果。结果表明，编号为228的寡肽效果最好，有望成为新的青枯病生物防治药剂。

关键词：抗菌肽;青枯菌;抑菌作用;生物防治

中图分类号：Q93

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2018）06-0092-03 国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2018.06.016

烟草青枯病（Tobacco bacterial wilt）是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）侵染引起的危害世界烟草生产的重要病害。此病1880年首次发现于美国，现已成为热带和亚热带烟区最常见的病害之一，在我国长江以南各烟区发生普遍[1]。对烟草青枯病的防治，主要有选用抗病品种、优化栽培管理和药剂防治这几个措施，但是没有十分理想的防治手段。近年来，寻找新的防治药剂的目光落在了抗菌肽（antimicrobial peptide）上面[2]。抗菌肽是动植物先天性免疫的重要组成部分，是动植物防御微生物入侵的一道有效屏障[3]。它们能作用于革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌、寄生虫、癌细胞甚至是薄膜病毒，而绝大多数抗菌肽对哺乳动物的正常细胞是无害的，并且杀菌机制与传统抗生素完全不同[4]。

本文在天蚕抗菌肽（Cecropin）的基础上，通过修饰天蚕抗菌肽肽序，设计了5种多肽，采用抑菌圈测定法研究其对烟草青枯菌的抑菌作用。

1 材料与方法

1.1 材料

所用的五种多肽由上海淘普生物科技有限公司合成（见表1）。烟草青枯病菌（R.solanacearum）由作者自己分离、纯化获得。

1.2 方法

于固体NA培养基上活化保存的青枯菌24 h（28℃），然后用接种环刮取活化的青枯菌到装有约125 mL液体NA培养基的锥形瓶，并将锥形瓶置于28℃、200 r/min的恒温振荡培养箱中培养24 h。24 h 取少许培养液，用紫外分光光度计测定其在490 nm处的吸光度，以蒸馏水作为对照，测得的OD值为1.70±0.05则可以直接用于下一步，如超过，则用无菌水稀释培养液到该吸光度（此吸光度青枯菌浓度为106～107 cfu/mL，处于对数生长期）。然后用移液枪取100 uL培养液到有固体NA培养基的培养皿上，并用玻璃细菌涂布棒涂抹均匀待用。

称取适量人工合成的冻干肽粉于2 mL规格无菌离心管中，并加无菌水稀释配成母液，再以母液加无菌水稀释到其他浓度，最后得到500 μg/mL、250 μg/mL和125 μg/mL三个浓度，分别用A、B、C表示。然后取适量灭菌滤纸片于装有肽溶液和无菌水的离心管中浸泡，将浸泡后的滤纸片用镊子夹出，放置于涂有细菌培养液的培养皿上，每个培养皿放同一处理的三个滤纸片，大致呈等边三角形，每个处理用两个培养皿，每个培养皿内做三个抑菌点测试，即相当于6个重复。最后将培养皿置于28℃恒温培养箱中倒置培养;于48 h后测量抑菌圈大小，记录并拍照。

2 结果与分析

本次实验中使用的多肽，对烟草青枯病菌均有一定的抑制作用。其抑制作用的大小，与多肽的浓度有关，高浓度的时候抑菌圈最大，即抑菌活性最强，低浓度的时候抑菌圈小，即抑菌活性最弱。不同的多肽，其抑制作用不同，其中抑菌效果最好的是编号为228的多肽，最差的是编号为222的多肽。

天蚕抗菌肽是一类具有抗菌活性的肽的总称，自从Steiner等1881年首次命名了两种天蚕抗菌肽以来[5]，在常用的在线抗菌肽据库APD（the Antimicrobial Peptides Database）和CAMPR3（Collection of Anti-Microbial Peptides）中，已经各自收录了37条和185条天蚕抗菌肽序列（含人工合成序列），是抗菌肽研究中的热门家族。但其对烟草青枯病菌是否具有抑菌作用，未见报道。在本试验中，只有11个氨基酸残基的寡肽比含有29个氨基酸残基的多肽抑菌效果好，和以前报道的研究结果相似[6-7]。

3 结论与讨论

在活性较强的4个寡肽中，虽然氨基酸残基一样，序列也高度相似，但是抑菌效果差别较大。抗菌肽的结构-活性关系研究发现至少有7个因素和肽的生物活性有关，它们是大小、肽序、结构度、净电荷、总疏水性、总亲水性、螺旋的疏水面和亲水面各自的宽度[8]。通过APD的结构预测工具，得知所有寡肽的净电荷都是 +4，但只有编号为228的寡肽的疏水性基团所占比例为54%，其它3种寡肽的疏水性基团所占比例均为63%，这可能在一定程度上影响了寡肽的活性。

利用抗菌肽防治烟草青枯病属于生物防治的一種，当前研究得比较多的生物防治方法是利用生防菌来防治烟草青枯病，即为传统的生物防治方法。肖田等[9]的研究指出，生防菌防治效果的好坏，除了与生防菌菌株产生的抑菌物质有关，还与该菌株是否能够在寄主上定殖、该菌株与致病菌位点竞争能力以及是否能够诱导寄主抗性等因素有关。这些因素，加上青枯菌的多样性和烟草不同的主栽品种，使得利用生防菌这种传统的生物防治方法的防治效果不稳定，或者前期防治效果好后期防治效果差的情况时有发生[10]。相比之下，抗菌肽直接作用于细菌的细胞膜[11-12]，所以受其他因素的影响程度比生防菌小。因此，将筛选到抑菌效果理想的抗菌肽，利用微生物发酵技术繁殖这种抗菌肽，用于生产中防治植物病害，是一种全新的生物防治技术，该方法属于现代生物防治方法。这种利用抗菌肽的现代生物防治方法在人类疫病防治方面应用较多，而在植物病害防治方面非常少。本研究以烟草青枯病为对象，进行了初步的抑制作用研究，仅仅是利用抗菌肽防治植物病害研究的开始，随后将进一步进行田间防效试验研究，为控制烟草青枯病提供新的生防技术。

參 考 文 献：

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[4] 徐灵龙，王云峰，石星明，等.抗菌肽及其功能研究[J].中国生物工程杂志，2007，27（1）：115-118.

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