Pi-ta、Pi-5、Pi-km和Pi-b基因在粳稻品种（系）中的分布及对穗颈瘟的抗性

张善磊 孙旭超 陈涛 赵春芳 朱镇 赵庆勇 周丽慧 赵 凌 姚姝 王才林

摘要：利用稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-5、Pi-km、Pi-b的功能标记，对国内外238份粳稻品种（系）进行基因检测，结合穗颈瘟鉴定结果，明确4个抗性基因的区域分布特点，评估其对穗颈瘟的抗性效果。Pi-ta和Pi-b主要分布在东北、长江中下游及西南地区品种（系）中，P1-5和Pi-km在西南地区品种中的分布高于其他地区。238份粳稻品种（系）中含Pi-ta、Pi-5、Pi-km、Pi-b单个抗性基因的品种（系）分别有33、30、29和38份;含2个抗性基因的品种（系）共有66份，其中含Pi-ta/Pi-b的品种（系）最多，有28份;同时含3个抗性基因的品种（系）有12份;4个基因均不含有的品种（系）有30份。Pi-ta对穗颈瘟的抗性效果最好，感病率为O，病情指数为22. 73;其次是P1-5和P/-km基因，病情指数分别为59. 17和70. 69;Pi-b对穗颈瘟的抗性效果最差，感病率为86. 840/0，病情指数为83. 55。双基因组合对穗颈瘟的抗性效果依次为：Pi-ta/P1-5>Pi-ta/Pi-km>Pi-ta/Pi-b>Pi-5/Pi-km;3份同时含有Pi-ta、Pi-5、Pi-km， 3基因的品种表现出最强的穗颈瘟抗性。

关键词：粳稻;穗颈瘟;抗性基因;分子标记

中图分类号：S511.2+20.34

文献标识码：A

文章编号： 1000-4440（ 2018） 05-0961-11

稻瘟病是由子囊菌[Magn，aporthe grisea（He-bert） Barr，无性态Pyricularia grisea（Cooke） Sacc.]引起的强流行性农作物病害之一，如遇高温、高湿的适宜环境条件，短期即可爆发流行。近年来，中国局部地区在2006年、2014年和2015年出现稻瘟病的大爆发和大流行、据统计，3年发病面积均超出5.0x106hm2，造成的实际产量损失均超过5.0x 105t。稻瘟病一直是水稻生产的重要病害，尤以穗颈瘟威胁最大。水稻穗期病菌侵入穗部形成暗褐色小点，后逐渐扩展到整个穗颈，使穗颈坏死，阻断养分输送，从而造成白穗，轻则减产10%～20%，重则减产40%—50%以上，个别重发田块甚至绝收。

生产上依赖喷施化学药剂防治稻瘟病，不仅会增加种植成本，还会带来环境污染和食品安全等问题。并且稻瘟病菌生理小种不断演化，抗药性逐渐增强。实践表明，选育和推广抗病品种是防治该病流行最经济、有效的手段。随着分子生物学和基因组学研究的深入，迄今为止，至少有350个微效QTL和86个主效抗病基因被报道，这些基因成簇地分布于水稻染色体上，其中有24个基因已被成功克隆，且Pi-ta、Pi-5、Pi-km和Pi-b等至少16个抗性基因均已开发出功能标记。

Pi-ta与Pi-b是最早克隆的稻瘟病抗性基因，被认为具有广谱、持久抗性，已报道对江苏省粳稻穗颈瘟具有明显抗性。Pi-km由2个独立功能紧密连锁的NBS-LRR类基因（Pi-kml-TS和Pi-km2-TS）组成，是pi位点上的一个主效抗病等位基因。王军等研究发现，Pi-ta、Pi-b和Pi-km与江苏省穗颈瘟抗性呈正相关，相关系数分别为0. 81、0.11和0.15。范方军等研究发现含Pi-ta或Pi-b、Pi-km和Pi54的3个基因组合材料的穗颈瘟抗性无4级高感，而其他抗性基因组合一般都存在4级高感。Pi-5与Pi-km，类似，是含2个独立的NBS-LRR类抗性基因。杨小林等研究发现Pi-5对湖北地区穗颈瘟具有很好的抗性表现。郑文静等[23]研究发现Pi-5单基因系对辽宁地区15个生理小种中的12个小种表现为中抗或抗病，抗谱较宽，是一个在辽宁地区可广为利用的广谱稻瘟病抗性基因，但其与江苏省穗颈瘟抗性关系还不是很清楚。因此，进一步明确Pi-ta、Pi-b、Pi-5、Pi-km抗性基因在粳稻栽培品种中的分布及与穗颈瘟的抗性关系，对粳稻稻瘟病抗性育种中亲本材料的选择具有重要意义。

本研究利用稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-5、Pi-km、Pi-b的功能标记，对国内外238份粳稻品种（系）进行基因型检测，分析这些抗性基因在供试材料中的区域分布和利用状况;通过穗颈瘟田间抗性鉴定，评价单基因及不同基因组合对穗颈瘟的抗性效果。本研究旨在分析稻瘟病抗性基因在粳稻栽培品种穗颈瘟抗性改良中的利用价值，为稻瘟病抗性育种提供可靠的种质资源。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为238份粳稻，包括：国内粳稻品种（系）222份，其中，东北地区粳稻品种21份、华北地区粳稻品种13份、长江中下游地区粳稻品种（系）167份、西北地区粳稻品种11份、西南地区粳稻品种10份：国外粳稻品种16份，含14份日本粳稻、2份韩国粳稻。以丽江新团黑谷及其携带Pi-ta、Pi-5、Pi-km、Pi-b的近等基因系为抗性基因对照材料，编号分别为IRBL32（丽江黑谷）、IRBL13（Pi-ta）、IR-BL20（P1-5）、IRBL25（Pi-km）、IRBL14（Pi-b）。供试材料均种植于江苏省农业科学院粮食作物研究所试验田。5月13日播種，6月13日移栽，每个品种（系）种植4行，每行12株，株行距13.3 cmx26.7cm，常规栽培方式管理。

1.2 穗颈瘟接种及抗性统计

稻瘟病菌供试菌株由江苏省农业科学院植物保护研究所提供，包括6个生理小种，分别为ZB，、ZC11、ZD7、ZE3、ZF1和ZG1，菌株均来自江苏省苏州市、连云港市等地。穗颈瘟抗性鉴定方法参照江苏省水稻品种（系）抗稻瘟病鉴定方法与抗性评价技术规程（DB32/T1123 2007）。在水稻孕穗破口前，用注射器将6个小种菌株的混合菌液注入穗苞，每个品种接种5个稻穗，稻成熟后期按穗颈瘟调查标准进行调查记载。分级标准为：0级（免疫），无病斑：1级（抗病），1/4以下支梗发病或穗颈有斑点：2级（中抗），1/4以上支梗发病或主轴中部发病，或颈部有病，但对产量影响不大：3级（感病），主轴中部或颈部发病，对产量有显著影响;4级（高感），穗颈发病造成白穗。

病情指数=∑（各级品种数×各级代表值）/（总品种数×最高级代表值），感病率=（3～4级品种数/总品种数）×100%。

1.3 DNA提取和稻瘟病抗性基因鉴定

水稻分蘖盛期采集各品种（系）幼嫩的新鲜叶片，采用卢扬江等的CTAB法并略作修改提取基因组DNA。Pi-ta基因鉴定：由2对引物Pita和NPi-to分别扩增抗病基因型和感病基因型：Pi-5基因鉴定：由3对引物JJ113-T3、JJ80-T3、JJ81-T3分别进行基因型鉴定：Pi-km基因鉴定：由2对引物Pi-kml和Pikm2分别进行基因型鉴定;Pi-b基因鉴定：由2对引物Pib和NPib分别扩增抗病基因型和感病基因型。4个稻瘟病抗性基因功能标记的引物名称、序列和扩增片段大小见表l。引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成。

1.4 PCR扩增和电泳检测

20μl的PCR反应总体系包含：ddH20 14.2μl，模板DNA（20ng/μl）2.0μl， 10×Buffer（25.0mmol/L）2.0μl， dNTP（2.5 mmol/L） 0.4μl，正、反向引物（10μmol/L）0.5μ1， Taq DNA聚合酶（2U/μl）0.4μl。PCR扩增反应条件：95 aC预变性4min;95℃变性30s，46—58℃复性30s，72℃延伸90s，35个循环;72℃延伸10 min。反应产物在2%琼脂糖凝胶上电泳分离，DuRed核酸染料染色后，在紫外凝胶成像仪上观察记载。

2 结果与分析

2.1 Pi-ta.、P/-5、Pi-km和Pi-b功能标记的验证及检测

利用稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-5、Pi-km和Pi-b的功能标记对238份粳稻品种（系）进行基因型检测。Pita引物檢测出1042 bp的预期条带，同时NPita引物不能检测出1 042 bp的预期条带，则该品种（系）含有Pi-ta抗病基因，反之，Pita引物不能检测出1 042 bp的预期条带，NPita引物能检测出1 042 bp的预期条带，则该品种（系）含有pi-ta感病基因（图1-A、图1-B、表2）：Pi-5由3对引物进行检测，在含有该抗性基因的品种（系）中，引物JJ80、JJ81、JJ113分别检测出442 bp、343 bp、484 bp的预期条带（图1-C、图1-D、图1-E、表2）;Pi-km基因需Pi-kml和Pi-km2进行检测，Pi-kml检测出174 bp的预期条带，同时Pi-km2检测出290 bp的预期条带，说明该品种（系）含有Pi-km抗病基因（图1-F、图1-G、表2）;Pib引物检测出365 bp的预期条带，同时NPib引物不能检测出803 bp的预期条带，则该品种（系）含有Pi-b抗病基因，反之，Pib引物不能检测出365 bp的预期条带，NPib引物能检测出803bp的预期条带，则该品种（系）含有pi-b感病基因（图1-H、图1-1、表2）。

2.2 Pi-ta、Pi-5、Pi-km和Pi-b在238份粳稻品种（系）中的区域分布

根据基因检测结果，统计4个稻瘟病抗性基因在238份粳稻品种（系）中的分布。Pi-ta、Pi-km和Pi-b的分布频率较高，分别为34.87%、30.25%和38.66%.而Pi-5较低，为21.43%。在区域分布上，Pi-ta和Pi-b集中于东北、长江中下游及西南地区粳稻品种（系）中，而在西北地区粳稻品种（系）、日韩粳稻品种中的含有率较低。Pi-5和Pi-km在西南地区粳稻品种（系）中的分布频率较高，分别为

2.3 不同抗性单基因及基因组合在粳稻品种（系）中的分布频率

根据基因鉴定结果，238份粳稻品种（系）中仅含单个抗性基因的品种（系）有130份，所占比例为54. 62%，包括33、30、29和38份分别含Pi-ta、Pi-5、Pi-km和Pi-b基因的品种（系），所占比例分别为13.87%、12.61%、12.18%和15.97%。含2个抗性基因的品种（系）有66份，所占比例为27.73%。其中，含Pi-ta/Pi-b基因的品种（系）数最多，为28份，所占比例为11.76%：含Pi-km/Pi-b基因的品种（系）次之，有14份，所占比例为5.88%：其他双基因组合Pi-ta/Pi-5、Pi-ta/Pi-km、Pi-5/Pi-km、Pi-5/Pi-b的出现频率较低，分别为1.68%、3.36%、3.78%和1.26%。含3个抗性基因的品种（系）有12份，所占比例为5. 04%。其中，含Pi-ta/Pi-5/Pi-km基因的品种有3份，含Pi-ta/Pi-km/Pi-b基因的品种（系）有7份，含Pi-5/Pi-km/Pi-b基因的品种（系）有2份。没有检测到同时含4个抗性基因的品种（系）。4个抗性基因均不含的品种（系）有30份，所占比例为12.61%（表4）。

根据上述对粳稻品种（系）的6个区域划分，分别统计了4个单基因及不同基因组合在不同地域的分布特点。长江中下游地区167份粳稻品种（系）中仅含单基因的品种（系）有100份，所占比例为59. 88%，其中单基因频率由高到低依次为Pi-b、Pi-ta、Pi-5、Pi-km，远高于含2个及以上抗性基因品种（系）的所占比例（28.14%）;47份含2个及以上基因的品种（系）中，频率最高的是含Pi-ta/Pi-b双基因的品种（系），高达25份，远高于含其他基因组合的品种（系），这可能与江苏省粳稻育种中侧重于Pi-ta和Pi-b组合的倾斜有关。与长江中下游地区类似，西北和日韩地区粳稻品种（系）大多只含单个抗性基因，抗性基因主要为Pi-km.东北、华北和西南地区品种（系）大多同时含2个抗性基因。Pi-ta/Pi-5基因组合的品种（系）在东北地区的分布频率最高，为14.29%，而在其他地区的品种（系）中几乎无分布;Pi-ta/Pi-km在西南地区的品种（系）中分布频率最高，为20.00%，远高于其他地区;Pi-5/Pi-km，在华北和西南地区的品种（系）中分布频率较其他地区高，分别为23.08%和20.00%。此外，Pi-km，/Pi-b在东北、西南和日韩地区的品种（系）中也具有较高的分布频率，三基因组合Pi-ta/Pi-5/Pi-km，在贵州的毕粳44号、辽宁的中丹2号和江苏的泗稻12号中检测到（表4）。

2.4 不同抗性单基因及基因组合对穗颈瘟的抗性效果

利用江苏省具有代表性的6个稻瘟病生理小种的混合菌液对238份粳稻品种（系）进行穗颈瘟抗性的田间接种鉴定。33份仅含Pi-ta单基因的品种（系）均表现为抗病，且抗病水平显著优于其他抗病基因，感病率为0，病情指数22.73。30份仅含Pi-5单基因的品种（系）中，有11份表现为抗病，19份表现为感病，感病率为63.33%，病情指数59.17。29份只含Pi-km的品种（系）中，有10份表现为抗病，11份为感病，8份为高感，感病率为65.52%，病情指数为70.69。38份只含Pi-b的品种（系）中，有5份表现为抗病，13份表现为感病，20份表现为高感，感病率为86.84%，病情指数为83.55。

双基因组合中，含Pi-ta/Pi-5和Pi-ta/Pi-km的品种（系）抗性效果最好，感病率均为0，病情指数分别为6.25和12.50.低于只含Pi-ta抗病基因品种（系）的病情指数：其次为含Pi-ta/Pi-b和Pi-5/Pi-km抗病基因的品种（系），感病率分别为0和11.11%，病情指数分别为27. 68和27. 78.远低于含Pi-b/Pi-5和Pi-b/Pi-km，的品种。三基因组合中，含Pi-ta/Pi-5/Pi-km的品种（系）抗性效果最好，其感病率和病情指数均为0，但品种数目较少，仅3份，后期仍需进一步验证（表5）。另外，发现在30份不含上述4个抗性基因的品种（系）中，有4份表现出抗病性，说明这些品种中可能还有其他的抗病基因。

3 討论

穗颈瘟一直是粳稻生产中的重要病害，在水稻孕穗期，病菌侵入穗部，阻碍养分输送，形成枯枝、白穗，从而造成产量严重损失。目前，选育和推广抗病品种是防止该病流行的有效手段。由于克隆的稻瘟病抗性基因数量较多且不同地区稻瘟病菌存在致病性的差异，因此，明确不同稻区具有针对性的基因或基因组合是决定抗病育种成败的重要工作。Pi-ta、Pi-5、Pi-km，和Pi-b基因具有广谱稻瘟病抗性，且近年来，Pi-ta/Pi-b作为江苏省粳稻抗穗颈瘟育种的优势组合，在育种中被广泛运用。王军等研究发现抗性基因Pi-ta、Pi-b与江苏省粳稻穗颈瘟抗性呈正相关，同时携带这2个基因可大大提高品种的穗颈瘟抗性。然而，宋兆强等研究发现Pi-b/Pi54、Pi-b的抗性逐年丧失，且Pi-ta、Pi-ta/Pi-b的抗性有减弱趋势。由此可见，加强挖掘Pi-ta/Pi-b的优势替代组合，扩大有利抗性基因的渗入和聚合，避免抗性基因组合单一化，有利于江苏省粳稻穗颈瘟抗性的维持和提高。

本研究利用稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi-5、Pi-km、Pi-b的功能标记，对238份粳稻品种（系）的基因进行检测.结合穗颈瘟抗性接种鉴定结果，明确这些抗性基因及基因组合在粳稻栽培品种（系）中的分布特点，以及对江苏省粳稻穗颈瘟的抗性效果。238份粳稻品种（系）中4个抗性基因的分布存在明显差异，其中，Pi-b的分布频率最高，占供试总材料的38.66%，38份仅含有该基因的品种（系）中有33份表现感病，其中高感品种多达20份。而相对于Pi-b，仅含Pi-ta的33份品种（系）均表现为抗病性，其中9份的抗性等级为0级：含Pi-ta/Pi-b双基因组合的品种（系）具有与仅含Pi-ta单基因品种（系）相同的抗病性。以前的研究者认为，同时含Pi-ta、Pi-b基因的品种对穗颈瘟抗性优于含单个基因的品种，这与本研究结果不一致，本研究中Pi-b基因表现出对穗颈瘟抗性的明显丧失，可能与稻瘟病菌生理小种的变异有关。本研究中Pi-ta的抗性效果与前人报道类似，具有极好的穗颈瘟抗性的效果，该基因主要分布于长江中下游省份特别是江苏省的栽培粳稻中，而在其他地区则极少存在，说明该基因可以进一步的扩大使用，特别是在稻瘟病高发的四川等地。可以利用将携带Pi-ta基因的品种通过杂交和标记辅助选择方式，将目标基因定向导人到感病品种中，改良品种的抗性效果。

Pi-5与Pi-km同属于含2个独立的NBS-LRR类抗性基因，在抗性育种中亦具有较高的利用价值。王丽丽等研究发现，粳稻品种中聚合Pi-ta与Pi-5对辽宁稻区的稻瘟病抗性贡献最大。阎勇等研究发现，含有Pi-ta/Pi-km双基因的稻株较仅含Pi-ta基因的稻株表现更强的稻瘟病抗性。本研究中检测到仅含Pi-5或Pi-km基因的粳稻品种（系）分别为30份和29份，病情指数分别为59.17和70.69，明显优于Pi-b基因的抗性水平（病情指数83. 55）。含Pi-5/Pi-km双基因组合的9份品种中，仅有1份表现为感病，其抗病性明显高于含其中任一个单基因的品种（系）。4份含Pi-ta/Pi-5和8份含Pi-ta/Pi-km双基因的品种（系）均较含Pi-ta/Pi-b和Pi-ta基因的品种（系）具有更强的穗颈瘟抗性。3份含Pi-ta/P1-5/Pi-km，三基因组合的品种（系）均表现免疫，病情指数为0。这些结果说明Pi-5和Pi-km，可能是穗颈瘟抗性的微效基因，且抗性效果具有累加作用。因此，在粳稻穗颈瘟抗性育种中，我们应该使用多种抗性基因聚合的方式改良品种的抗性。根据本研究结果，可以将Pi-ta、Pi-5和Pi-km进行同时聚合，培育出如毕粳44号（贵州）、中丹2号（辽宁）和泗稻12号（江苏）对稻瘟病菌高度免疫的高抗品种，从而避免稻瘟病菌生理小种变异而带来的潜在风险。