基于UPLC特征图谱与主成分分析的白芷配方颗粒质量评价

孙福仁 李军山 马浩 李雪利 冀艳花 李振江

摘 要：為了评价不同厂家白芷配方颗粒的产品质量，建立了白芷配方颗粒的特征图谱与主成分分析方法。采用Waters Uplc Class H超高效液相色谱仪与Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（21 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱，以乙腈-水为流动相，柱温为25 ℃，流速为0.2 mL/min，检测波长为254 nm，利用指纹图谱相似度评价软件提取白芷配方颗粒特征图谱中的特征成分，使用参照物标定5个特征峰的成分;采用SPSS 19.0软件进行主成分分析，给出了不同厂家白芷配方颗粒在2个主成分上的分布图，并对不同厂家白芷配方颗粒进行了综合评分。结果表明：10批白芷配方颗粒特征图谱确定的13个特征峰中，指认出了花椒毒酚、水合氧化前胡素、欧前胡素、蛇床子素、异欧前胡素5种成分;以回归得到的3个主成分的矩阵回归系数与方差贡献值的乘积之和作为10批样品的综合评分，排名第一的综合评分为1.77。基于UPLC特征图谱与主成分分析法能够快速、有效地检测和评价白芷配方颗粒。

关键词：医药工程;白芷配方颗粒;UPLC;特征图谱;主成分分析

中图分类号：R917   文献标志码：A

Evaluation of the quality of formula granule of Angelicae

dahuricae based on UPLC and PCA

SUN Furen1， LI Junshan1，2， MA Hao1， LI Xueli1， JI Yanhua1， LI Zhenjiang1

（1.Shineway Pharmaceutical Group Company Limited， Shijiazhuang， Hebei 051430， China;2.TCM Formula Granule Engineering Technology Research Center of Hebei， Shijiazhuang， Hebei 050200， China）

Abstract：In order to evaluate the product quality of Angelica dahurica formula granules from different manufacturers， the feature chromatograms and principal component analysis method of Angelica dahurica formula granules are established. The WATERS UPLC CLASS H and Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm） are applied in the method. The mobile phase is acetonitrile-water solution. The column temperature is 25 ℃， the flow rate is 0.2 mL/min and the detection wavelength is 254 nm. The fingerprint similarity evaluation software is used to extract the characteristic components in the characteristic map of Angelica dahurica formula particles， and the components of the five characteristic peaks are calibrated by using a reference. Based on the similarity evaluation of fingerprints and SPSS 19.0， five peaks are identified as the common peaks of 10 batches of samples， PCA are used to analysis 10 batches of samples and 10 batches of samples are ranked in the comprehensive scores. The results show the 13 characteristic peaks identified in the characteristic map of the 10 batches of Angelica dahurica formula granules， five components are identified： Xanthohumol， hydrated oxypeucedanin， imperatorin， osthole and isoimperatorin. The sum of the product of the matrix regression coefficients of the three principal components obtained by regression and the variance contribution value is used as the comprehensive score of the 10 batches of samples， with the first comprehensive score of 1.77.  The method is simple and reliable， and can be used to control and value the quality of formula granule of Angelicae dahuricae .

Keywords：pharmaceutical engineering; formula granule of Angelicae dahuricae radix; UPLC; feature chromatograms; PCA

白芷为伞形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.的干燥根[1]。白芷中含有水合氧化前胡内酯、比克白芷素、异氧化前胡内酯、珊瑚菜内酯、异欧前胡素、佛手柑内酯、花椒毒酚、豆甾醇、胡萝卜苷等[2]。白芷为常用中药，临床应用广泛。现代药理学研究表明，白芷具有解热、镇痛、抗炎的功效，其脂溶性部位含有抗炎、镇痛的有效成分[3-6]。白芷乙醇提取物可显著延长小鼠热板反应的潜伏期，以及扭体反应出现的时间[7]。

为了控制白芷饮片的质量，有学者应用HPLC色谱法，对不同产地的白芷饮片进行了指纹图谱研究[8-10]。还有文献报道了使用HPLC法，对白芷提取物进行了相关分析[11]。例如：卢晓琳等[12]对白芷提取物进行了性状、鉴别、检查研究，应用HPLC法建立了白芷提取物的质量标准;何姗姗等[13]通过调整光照、温度、pH值、金属离子等因素，考察了白芷提取物的稳定性。然而，目前，以白芷配方颗粒为对象进行质量控制方法方面的研究文献较少。笔者以不同厂家生产的白芷配方颗粒为研究对象，通过特征图谱相似度分析并结合主成分分析方法，对白芷配方颗粒进行了综合评分。

1 主要仪器与材料

1.1 仪器

WATERS UPLC CLASS H超高效液相色谱仪，沃特世仪器设备有限公司提供;Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）;CP225D型电子分析天平，赛多利斯公司提供;KH3200E型超声波清洗器，江苏昆山禾创超声仪器有限公司提供。

1.2 试剂

花椒毒酚对照品，批号为110737-201516，中国食品药品检定研究院提供;水合氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素、蛇床子素，成都曼思特生物科技有限公司提供;甲醇，分析纯，批号为20170309，天津市科密欧化学试剂有限公司提供;乙腈，批号为20170313，天津市科密欧化学试剂有限公司提供。

1.3 配方颗粒

对从市场采购的10批白芷配方颗粒均按不同厂家、批号进行分类，详见表1。

2 实验部分

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相为乙腈（A）- 水（B），梯度洗脱条件见表2，流速为0.2 mL/min，检测波长为254 nm，柱温为25 ℃，进样量为1 μL。

2.2 对照品溶液的制备

取花椒毒酚、水合氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素、蛇床子素对照品适量，精密称定，置于容量瓶中。加入甲醇制成每l mL含花椒毒酚12，10，15，20，10 μg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取白芷配方颗粒适量，研细，取0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇25 mL，密塞，超声处理（功率为200 W，频率为40 kHz）30 min，放冷，摇匀，过滤，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度考察

取编号S4白芷配方颗粒，根据供试品溶液制备方法，按照“2.1”色谱条件，连续进样6次，计算相对保留时间与相对峰面积。结果显示，13个特征峰相对保留时间的RSD值为0.11%～0.14%，相对峰面积的RSD值为0.15%～1.06%。表明13个主要色谱峰的保留时间与峰面积精密度良好，符合特征图谱技术要求。

2.4.2 重复性考察

取编号S4白芷配方颗粒，根据供试品溶液制备方法，平行制备6份供试品，按“2.1”色譜条件测定，计算相对保留时间与相对峰面积。结果显示，13个特征峰相对保留时间的RSD值为0.02%～0.72%，相对峰面积的RSD值为0.48%～1.45%。表明13个主要色谱峰的保留时间与峰面积的重复性良好，符合特征图谱技术要求。

2.4.3 稳定性考察

取编号S5白芷配方颗粒，按“2.3”项下方法制备，分别于0，2，4，6，8，10 h进行测定，计算相对保留时间与相对峰面积。结果显示，表明13个特征峰相对保留时间的RSD值为0.09%～0.18%，相对峰面积的RSD值为0.12%～1.91%。表明13个主要色谱峰稳定性良好，符合特征图谱技术要求。

3 结果及分析

3.1 白芷配方颗粒UPLC特征图谱测定

取10批白芷配方颗粒，分别按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样，记录色谱图，见图1。

对10批白芷配方颗粒特征图谱进行分析，确定了13个特征峰，通过与标准品保留时间和紫外最大吸收的比对，指认了13个特征峰中的5个成分：2号峰为花椒毒酚，4号峰为水合氧化前胡素，11号峰为欧前胡素，12号峰为蛇床子素，13号峰为异欧前胡素，详见图2。

3.2 数据分析

采用《中药色谱指纹图谱和相似度评价系统》（2012版），选取时间窗宽度为0.1 min，以中位数生成对照色谱图，经过多点校正后自动匹配，生成白芷配方颗粒UPLC特征图谱的对照谱图[14-15]。

通过与白芷配方颗粒对照谱图比较可知，欧前胡素、异欧前胡素、蛇床子素3个特征峰只在2

个厂家生产的白芷配方颗粒中检测到，而在其他厂家生产的白芷配方颗粒中均未检测到上述3种成分。

由于对照图谱中13个特征峰的分离度较好，故选用13个特征峰的峰面积作为统计数据，运用SPSS 19.0版软件，以10批白芷配方颗粒为分析对象，进行主成分分析，结果见表3。

由表3可知，提取到3个成分时方差累积已达到93.58%，可以代表整个样品的信息，故提取到3个主成分。使用回归得到的3个主成分的矩阵回归系数与方差贡献值的乘积之和作为10批样品的综合评分，进行排序，结果见表4和图3。

由表4可知，编号S4和S5白芷配方颗粒的综合评分靠前，而其他厂家样品的综合评分靠后。由图3可知，样品S4和S5在主成分1、主成分2上的分布与其他样品的距离较远，且其余样品的分布较为集中，都处于主成分1和主成分2的负数区，表明不同厂家生产的白芷配方颗粒的差异较大。

4 讨 论

4.1 提取溶剂及提取方式的考察

对10%，30%，50%甲醇水溶液与100%甲醇进行比较可知，以甲醇提取的样品中的色谱峰个数较多，峰型较好，故选择甲醇作为提取溶剂。对比了超声与回流2种提取方式，超声提取样品中峰的个数多、峰面积较大，回流提取的峰面积较小，因此选用超声提取。通过对25，50，70 mL提取溶剂用量进行考察，最终确定了25 mL作为提取溶剂的用量。

4.2 色谱条件的考察

分别考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.5%磷酸水3个流动相体系。结果表明，采用乙腈-水溶液作为流动相体系时，特征图谱中的主要色谱峰的分离较好，基线波动小，有利于特征图谱的数据采集，有效确保数据的可重现性。因此，确定乙腈-水溶液作为流动相。

4.3 检测波长的筛选

分别选用254，275，300 nm作为检测波长进行实验，发现在不同波长下各色谱峰的峰面积有较大差异。综合考虑发现，在254 nm下测定，各色谱峰的分离度较好，基线平稳，故选择254 nm作为检测波长。

5 结 语

1）《中華人民共和国药典》2015版中规定，在对白芷饮片含量测定时以欧前胡素为指标，说明欧前胡素是白芷饮片质量控制的关键。白芷配方颗粒是由白芷饮片经提取、浓缩、干燥、制粒而得的。采用建立的UPLC特征图谱方法，对不同厂家白芷配方颗粒测定后发现，只有2家的产品中检测到了欧前胡素、异欧前胡素、蛇床子素成分，其余厂家样品中均未检测到。

2）由于欧前胡素、异欧前胡素、蛇床子素的水溶性差，在生产过程中若仅用水作为提取溶媒，产品中所含的微量欧前胡素、异欧前胡素、蛇床子素等香豆素类成分难以达到标准要求。所以，生产白芷配方颗粒时，应该兼顾药材中各种化学成分的特性，确定合理的提取工艺，最大限度地保留中药饮片中的指标成分，确保疗效。

3）本次研究采用特征图谱技术结合主成分分析，对10批不同厂家的白芷配方颗粒进行了分析和评价。由于各厂家配方颗粒生产工艺条件的差异，导致白芷配方颗粒中化学成分产生较大变化，今后需要对此作进一步的研究。

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