“固液双层”培养法诱导马铃薯‘米拉’试管薯的研究

方志荣 周才懿 李佩华 清源

摘 要： 该研究以马铃薯‘米拉品种的脱毒试管苗为材料，采用“固液双层”的培养方式，通过正交试验对其试管苗壮苗生长阶段和试管薯诱导阶段的培养基进行优化，并通过单因素试验研究蔗糖浓度、光照条件和CCC浓度对试管薯结薯的影响。结果表明：在“固液双层”培养中，‘米拉壮苗培养阶段优化的培养基为改良MS培养基（硝酸铵为2 000 mg·L-1、硝酸钾为2 000 mg·L-1）+ 500 mg·L-1 CCC + 0.1% 活性炭 + 0.1 mg·L-1 DA-6 + 1 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 NAA + 3%蔗糖 + 6 g·L-1 琼脂，pH 5.8。试管薯诱导及生长阶段优化的培养基为MS1培养基（微量元素和铁盐的用量为MS培养基的2倍）+ 1.5% 活性炭+ 4 mg·L-1 6-BA + 8%蔗糖。在试管薯诱导阶段，弱光4 h·d-1培养诱导的试管薯，结薯指数、大薯率、薯块重量均优于暗培养。“固液双层”培养是一种低成本的方法，在组织培养室内就可以大量繁殖‘米拉试管薯，并且能增加原种的数量，这种方法也能用于马铃薯其他栽培品种试管薯的诱导。

关键词： 马铃薯， 试管薯， 6-苄基腺嘌呤， 矮壮素， 活性炭， 胺鲜酯， 组织培养

中图分类号： Q945.51 文献标识码： A 文章编号： 1000-3142（2018）09-1172-11

Abstract： Virus-free plantlets of potato cultivar ‘Mira were used as experimental material to induce potato microtuber by a two-step culture method. In the first step， nodal cuttings （with one or two leaf） of potato plantlets were inoculated solid medium for culturing vigorous potato plantlats. After 20 d， liquid medium was added on the solid medium to proceed to the second step for induction of potato microtuber. The optimum culture media at the stages of culturing vigorous potato plantlets and induction of potato microtuber were obtained by means of orthogonal design， and the effects of sucrose concentration， light condition and CCC concentration on induction of potato microtuber were also studied. The results were as follows： the optimal medium at the stage of culturing vigorous potato plantlets was modified by MS medium （NH4NO3 was changed to 2 000 mg·L-1 and KNO3 was changed to 2 000 mg·L-1 in MS medium）+ 500 mg·L-1 CCC + 0.1% activated carbon + 0.1 mg·L-1 DA-6 + 1 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 NAA + 3% sucrose + 6 g·L-1 agar， pH 5.8， the optimal medium at the stage of induction of potato microtuber was MS1 medium [two times of FeSO4 （Na2EDTA） and trace elements in MS medium] + 1.5% activated carbon + 4 mg·L-1 6-BA + 8% sucrose. The results also showed that illumination with dim light for 4 h·d-1 could obtain potato microtubers with higher frequency of tuberization and big microtubers than dark treatment. The results indicated that“solid + liquid” double-layer culture can be applied for mass propagation of potato tubers ‘Mira at low cost in the plant tissue culture room， and can increase the number of pre-elite seed potatoes. This method can also be used for the production of microtuber of other potato cultivars.

Key words： potato， microtuber， 6-BA， CCC， activated carbon， DA-6， tissue culture

涼山州位于四川省的西南部，属于典型的高原山地，区内光照充足、昼夜温差大，有利于马铃薯生长，是四川省马铃薯主产区，尤其是二半山（海拔1 500 m）以上的彝族聚居区，马铃薯既是当地农民的主要粮食来源，也是主要的经济来源，在这些地区发展马铃薯产业是贫困彝区农民脱贫致富的重要渠道。2015年，凉山州马铃薯平均单产22.5 t·hm-2，远低于美国、比利时、新西兰等国的46.9～48.7 t·hm-2（世界粮农组织资料）。实践证明，推广应用脱毒种薯能显著提高马铃薯的产量和品质。目前，凉山州生产的脱毒种薯是以脱毒苗为基础，经过炼苗、洗苗、移栽驯化等繁琐、复杂的过程，脱毒种薯成本高，夏季网室大棚温度高，不能进行原种生产，导致凉山州内脱毒种薯远远不能满足生产的需求。马铃薯脱毒试管薯（microtubers）是指培养瓶内的试管苗通过诱导培养，于叶腋内形成直径为2～10 mm大小的块茎（Vander Zaag， 1988）。马铃薯试管薯是继脱毒试管苗之后发展起来的一种种质保存和生产脱毒种薯的新形式，它体积小、重量轻，便于贮藏、运输和保存，可以作为“种子”在大田中大规模种植，既能加快脱毒种薯的繁殖，缩短种薯生产周期，又能周年繁殖，应用已日益广泛。此外，马铃薯试管薯被用于马铃薯基因工程研究中作为遗传转化的受体。

影响马铃薯试管薯形成的因素很多，除与基因型（Khalil et al， 2017；Gopal et al， 2004）有关外，还受温度（ 蒋从莲和郭华春， 2007； 马伟清等， 2010）、培养方式（ 帅正彬等， 2004；白淑霞等， 2002）、光照（Hussain et al， 2006）、碳源（Gopal et al， 2004）、矿质营养（ Radouani & Lauer， 2015；马伟青等， 1999）、植物生长调节剂（Gopal et al， 2004）等多种因素的影响。Pelacho & Mingo-Castel （1991）指出，只有在诱导结薯的前一阶段培养出茎干粗壮、根系发达、叶色浓绿的试管苗，才能获得优质、高产的试管薯。因此，试管薯一般通过两步法诱导，即先将马铃薯脱毒试管苗接种到壮苗培养基上进行壮苗，然后进行试管薯诱导。不同培养方式诱导试管薯的研究表明：在相同浓度条件下，液体培养基诱导的试管薯在结薯率、薯块重量、薯块直径方面优于固体培养基（ Piao et al， 2003； 白淑霞等， 2002）。但是，液体培养操作繁琐、污染率高、试管苗易折断、灭菌成本高。“固体+液体”的“固液双层”培养方式虽然结薯率低一点，但相比液体培养方式操作简单、污染率低、灭菌用电少，适合大规模生产使用（帅正彬等， 2004）。本研究采用“固液双层”培养体系，使用正交试验设计对壮苗阶段和试管薯诱导阶段的培养基成分进行优化，并研究光照、蔗糖浓度及CCC 浓度对试管薯结薯的影响，以期能找到操作简便、生长周期短的试管苗及试管薯的高效培养和诱导技术，为试管薯的培养提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为本实验室脱毒的‘米拉（Mira）试管苗。在无菌条件下，将试管苗切成带1～2个叶节的茎段后接种于继代培养基，每瓶15～20苗， 接种后的培养瓶置于光照强度2 000～4 000 lx、光照时间16 h·d-1、温度（25±2）℃条件下培养，待苗长至约10 cm时备用。

1.2 方法

1.2.1 壮苗培养 取出‘米拉试管苗，在无菌条件下切成单节茎段，接种到壮苗培养基中，每瓶接种10个茎段。壮苗培养基成分为基础培养基 + CCC + 活性炭 + DA-6 + 1 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 NAA + 3%蔗糖 + 6 g·L-1 琼脂，pH 5.8；基础培养基，CCC、AC和DA-6的成分和浓度水平采用四因素三水平的正交设计进行试验（表1），共9个处理，每个处理5瓶，接种后的培养瓶置于光照强度2 000～4 000 lx、光照時间16 h·d-1、温度（25±2）℃的条件下培养20 d，统计各个处理的根数、茎粗、节间长度、鲜重和叶面积，找出适合‘米拉脱毒试管苗的壮苗培养基。

1.2.2 试管薯诱导培养 试管薯的诱导采用固液双层培养的方法，在无菌条件将20 mL无菌的液体培养基加入试管苗进行壮苗培养后的培养瓶中，液体培养基成分为基础培养基 + 蔗糖 + 6-BA + 活性炭，pH 5.8。基础培养基、6-BA、活性炭和蔗糖的组合和浓度采用四因素三水平的正交设计进行试验（表2），共9个处理，每处理5瓶，接种后在温度（25±2）℃、弱光4 h·d-1的条件下诱导结薯。诱导培养40 d后，统计各处理的成薯指数（结薯数/结薯株数）、薯块重量（g）、大薯率（质量>0.1 g）和薯块直径等，找出适合‘米拉试管薯的诱导培养基。

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 光照对试管薯结薯的影响 采用优化后的壮苗培养基进行壮苗培养，20 d后向培养瓶中加入20 mL的试管薯诱导优化培养基，然后将培养瓶分别放在（25±2）℃下弱光4 h·d-1、弱光8 h·d-1、或全黑暗条件下进行培养，每个处理5瓶，40 d后观测，筛选利于试管薯结薯的光照条件。

1.2.3.2 蔗糖浓度对试管薯结薯的影响 采用优化后的壮苗培养基进行壮苗培养，20 d后向培养瓶中加入20 mL的无菌试管薯诱导培养基，诱导培养基中的蔗糖浓度为2%、4%、6%、8%，之后在（25±2）℃、弱光4 h·d-1条件下进行培养，40 d后观测，筛选利于试管薯结薯的蔗糖浓度。

1.2.3.3 矮壮素浓度对试管薯结薯的影响 壮苗培养基采用改良MS培养基 + CCC + 1% 活性炭 + 0.1 mg·L-1 DA-6 + 1 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 NAA + 3%蔗糖 + 6 g·L-1 琼脂，pH 5.8，CCC的浓度为100 mg·L-1和500 mg·L-1进行试管苗的壮苗培养，20 d后向培养瓶中加入20 mL的无菌试管薯诱导优化培养基，然后将培养瓶分别放在（25±2）℃、弱光4 h·d-1条件下进行培养，每个处理5瓶，40 d后观测，确定壮苗培养阶段培养基中不同CCC浓度对试管薯结薯的影响。

1.3 数据收集和处理

所有数据用SPSS 22.0软件进行统计分析。其中，壮苗培养基和试管薯诱导培养基的优化采用极差、方差分析，单因素试验采用方差分析并用LSD（P<0.05）法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 壮苗培养中最佳培养条件分析

2.1.1 不同处理对试管苗根数的影响 根的数量是判断试管苗生长优劣的参数之一。从表3可以看出，处理组合为A1B2C2D2培养出的根数最多，每株达到4.9根，且根的长势较理想；各因素各水平极差分析结果（表4）表明，各因素对根数的影响顺序为培养基种类 >活性炭 > DA-6 > CCC。在改良的MS培养基上根数相对较多，2MS培养基上的组培苗根数少，长势弱。诱导根的最优组合为A1B2C2D1。

2.1.2 不同处理对试管苗茎粗的影响 植株的茎粗可以反应植株生长的健壮程度，从表3可以看出，处理组合为A1B2C2D2最健壮，达到每株1.62 mm，其余的8个处理组合在茎粗上无显著差异。表4结果表明，CCC、活性炭、培养基种类、DA-6对茎粗的影响程度大致相等。

2.1.3 不同处理对试管苗节间长度的影响 从表3可以看出，处理组合A3B3C1D2节间长度最短，为2.90 mm，处理组合为A1B2C2D2节间长度为3.87 mm，但二者未表现出显著差异。处理组合A1B3C3D3的节间长度最大，达到8.27 mm。各因素各水平极差分析结果（表4）表明，各因素对节间长度影响顺序为培养基种类 > CCC > DA-6 > 活性炭。节间长度最短的优化培养基配方为A3B2C2D2。

2.1.4 不同处理对试管苗叶面积的影响 叶片是植物进行光合作用的器官，叶面积的大小又与植株的健壮度相关。从表3可以看出， 各处理组合之间，叶面积存在显著差异；其中，组合A1B2C2D2叶面积最大，达到0.27 cm2；组合A2B3C2D1、A3B1C2D3、A1B3C3D3、A2B1C3D2最小，叶片较细。各因素各水平极差分析结果（表4）表明，各因素对叶面积的影响顺序为培养基种类≈CCC >DA-6≈活性炭。叶面积最大的最优组合为A1B2C2D2。

2.1.5 不同处理对试管苗鲜重的影响 由于培养容器面积及高度有限，因此鲜重最能直接反映出植株的健壮程度。从表3可以看出，处理组合A1B2C2D2鲜重最大，每株达0.20 g；处理组合A2B3C2D1、A2B2C1D3、A3B3C1D2鲜重最低，植株较纤细。各因素各水平极差分析结果（表4）表明，各因素对鲜重的影响顺序为DA-6>CCC>培养基种类≈活性炭。适当浓度的DA-6能促进试管苗鲜重的增加，在四因素中对鲜重的影响最大，其次为CCC，培养基种类和活性炭的影响最小。鲜重最大的优化培养基配方为A1B2C2D2。

综合考虑，本研究选择A1B2C2D2，即改良MS + 100 mg·L-1 CCC + 0.1% 活性炭 + 0.1 mg·L-1 DA-6 + 1 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 NAA + 3%蔗糖+ 6 g·L-1琼脂，pH 5.8作为壮苗培养基的优化培养基配方，利用该配方进行壮苗培养，根数、茎粗、鲜重、叶面积在所有处理中最大，而节间长度较短，达到壮苗培养要求。

2.2 试管薯诱导培养基及最佳培养条件分析

2.2.1 不同处理对试管薯成薯指数的影响 由表5可知，不同处理组合对成薯指数有显著影响，处理组合A1B2C3D2成薯指数最大（为1.23），其次为处理组合A3B3C3D1，成薯指数为0.87，其余组合成薯指数无显著差异。各因素、各水平极差分析结果（表6）表明，各因素对成薯指数的影响顺序为6-BA > 活性炭 > 蔗糖 > 培养基种类，适当浓度的6-BA能增加成薯指数，对成薯指数的影响最大，其次为活性炭，蔗糖和培养基种类对成薯指数的影响较小。成薯指数最大的培养基组合为A1B2C3D2。

2.2.2 不同处理对试管薯薯块重量的影响 由表5可知，组合A1B2C3D2薯块重量最大，为每粒0.25 g，且与其他处理差异显著。极差分析结果（表6）表明，各因素对试管薯薯块重量的影响顺序为6-BA >活性炭 > 培养基种类 > 蔗糖，表明可以通过适当调整6-BA和活性炭浓度增加薯块重量。诱导薯块重量增加的最优培养基组合为A1B2C3D2。

2.2.3 不同处理对试管薯大薯率的影响 由表5 可知，处理组合A1B2C3D2大薯率最大（为66.15%）；处理组合A2B3C2D2、A3B3C3D1、 A1B3C2D3与A1B2C3D2无显著差异；处理组合A1B1C1D1大薯率最小（为9.34%）。表6结果表明，各因素对试管薯大薯率的影响顺序为6-BA > 培养基种类 > 活性炭 > 蔗糖；适当浓度的6-BA能增加大薯率，对大薯率的影响最大，培养基种类次之，增加KH2PO4的使用量能提高大薯率，活性炭和蔗糖對大薯率的影响相对较小。大薯率最高的培养基组合为A1B3C3D2。

2.2.4 不同处理对试管薯薯块直径的影响 由表5可知，处理组合A1B2C3D2薯块直径最大（为6.3 mm），与其他组合存在显著差异，处理组合A1B1C1D1薯块直径最小（仅为2.2 mm）。表6结果表明，各因素对试管薯薯块直径的影响顺序为活性炭>培养基种类≈6-BA >蔗糖；活性炭浓度的增加能提高薯块的直径，对薯块直径的影响最大，其次为培养基种类和6-BA， 蔗糖浓度影响最小。薯块直径最大的培养基组合为A1B2C3D2。

综合考虑，选择组合A1B2C3D2，即 MS1+ 1.5% 活性炭 + 4 mg·L-1 6-BA + 8%蔗糖为试管薯诱导的适合培养基。

2.3 单因素试验结果

2.3.1 光照对结薯率的影响 光照是影响马铃薯

试管薯形成的主要因素，由表7可知，随着光照时间的延长，弱光8 h·d-1处理成薯指数和最大薯重显著增加；但平均薯重弱光8 h·d-1与黑暗培养无显著差异；大薯率弱光8 h·d-1处理明显低于弱光4 h·d-1及黑暗培养；而薯块直径则是弱光4 h·d-1和弱光8 h·d-1处理高于黑暗培养。大薯率是试管薯诱导中的一个重要指标，应在保证大薯率的前提下，兼顾平均薯重、薯块直径和成薯指数等参数。因此认为，最佳结薯的光照条件应为弱光处理4 h·d-1。

2.3.2 蔗糖浓度对试管薯结薯的影响 从表8可以看出，随着蔗糖浓度的增加，成薯指数和大薯率显著增加；在8%的蔗糖浓度下，成薯指数达1.25，大薯率达到95.63%，最大薯重达到每粒0.491 g；在薯块重量和薯块直径方面，8%的蔗糖浓度与4%和6%无显著差异，但明显高于2%（表8）。10%和12%的高蔗糖浓度下，试管薯的成薯指数、薯块重量、大薯率和薯块直径都明显下降（表6）。因此认为，适宜的蔗糖浓度应为8%。

2.3.3 矮壮素浓度对试管薯结薯的影响 由表9可知，500 mg·L-1 CCC处理与100 mg·L-1 CCC处理相比，成薯指数与最大薯重分别提高了29.72%和14.71%。前期壮苗阶段，CCC的浓度宜采用500 mg·L-1。

3 討论

在马铃薯试管薯结薯研究中，邱彩玲等（2008）发现，试管苗长势与试管薯均粒重成显著或极显著正相关，健壮试管苗比幼嫩试管苗容易结薯（鄢铮和郭德章， 2004）。因此，培育健壮试管苗是生产较大试管薯的先决条件。“固液双层”培养方式可以对试管苗生长阶段和试管薯诱导及生长阶段进行调控，已成为试管薯诱导的常用方法（白淑霞等， 2002；帅正彬等， 2004；王瑞斌等， 2006）。

在马铃薯试管苗壮苗培养中，在原MS培养基的基础上将硝酸铵浓度变为2 000 mg·L-1、硝酸钾浓度变为2 000 mg·L-1，与MS和2倍MS培养基相比，植株鲜重和叶面积增加，植株长势粗壮，节间缩短，这与马伟青等（1999）的研究结论一致；但在另外的研究中发现，2倍MS培养基能促进马铃薯‘克新4号和‘克新2号试管苗的生长，使其健壮生长（金顺福等，1995），这与本研究结果不一致，可能跟马铃薯的品种和基因型差异有关（Khalil et al， 2017）。CCC是一种植物生长延缓剂，能使试管苗节间缩短，茎粗、叶片数和有效扩繁节段数增加，但过高浓度则引起毒害，如导致过度低矮、叶片反卷、叶片黄化脱落等现象（吴艳清等， 2015）。本研究发现100 mg·L-1 CCC 下植株鲜重最大，500 mg·L-1 CCC抑制了植物的生长，明显地缩短了节间长度，但未表现出明显的毒性。胺鲜酯（DA-6， 2-N，N-乙氨基乙基己酸酯）是广谱性细胞分裂素类植物生长调节剂，一定浓度的DA-6能提高草莓植株的叶面积、光合速率以及叶绿素含量，增加草莓的单产（苗鹏飞等， 2007）。DA-6在马铃薯试管苗的繁殖方面鲜有报道， 本研究发现0.1 mg·L-1 DA-6 使马铃薯‘米拉试管苗植株鲜重、叶面积和茎粗增加，节间长度缩短，植株长势粗壮，因此DA-6可用于马铃薯试管薯的扩繁中。在培养基中加入适量的活性碳会促进试管苗的生长和生根（夏静波等， 2011）。本研究中，0.1%的活性炭对马铃薯‘米拉试管苗的生长有促进作用，表现为根数、茎粗、鲜重和叶面积增加，节间缩短，植株健壮等，可用于壮苗培养。

在马铃薯试管苗结薯培养中，将MS培养基中的微量元素和铁盐的用量改为原来的2倍，成薯指数、薯块重量、大薯率和薯块直径均得到提高。也有研究发现，将MS培养基中的微量元素提高4倍，可以诱导结薯（刘仁祥， 2001）；或将MS培养基中铁盐的用量改为原来的2倍，可以增加薯块重量（张志军， 2004）。我们在MS培养基的基础上，将KH2PO4的用量改为340 mg·L-1，成薯指数下降，大薯率增加。过高的磷酸二氢钾降低结薯数量，但薯块重量增加，建议将培养基的磷浓度调整为255 mg·L-1（张志军， 2004）。因此，MS培养基中的微量元素、铁盐及KH2PO4的用量还需要通过试验进一步优化。在马铃薯试管薯结薯培养中，为了缩短生产周期，提高试管薯的产量和质量，使用外源激素是必要的，其中6-BA常用且效果最为显著（胡云海和蒋先明， 1989；杨宏羽等， 2008）；本研究发现，在设定的因素和水平下，6-BA 对成薯指数，薯块重量，大薯率的影响最大，说明6-BA对马铃薯‘米拉试管苗的结薯是必须的。高浓度的蔗糖 （6%～10%）是试管薯诱导过程中必不可少的条件（胡云海和蒋先明， 1989；吕长文等， 2004；Gopal et al， 2004）；马铃薯‘米拉的结薯培养基中最适蔗糖浓度为8% （ Elaleem et al， 2015；胡云海和蒋先明， 1989； KhalilL et al， 2017），较高或较低的蔗糖浓度会对试管薯的诱导及生长产生不利的影响，这与本研究结果一致。活性炭作为一种吸附剂，在马铃薯试管薯的诱导方面具有明显的效果，促进马铃薯试管薯的生成，1.5%的活性炭增加试管薯的成薯指数、薯块重量、大薯率和薯块直径，此外活性炭的加入减弱了培养基中的光照，促进了营养物质的转移，并吸附了代谢中产生的有害物质，从而促进结薯。光照是影响马铃薯试管薯形成的主要原因，试管薯的诱导及生长需要在黑暗条件下完成（Hussain et al， 2006； 崔翠等， 2001； Ali et al， 2018； Elaleem et al， 2015）。马铃薯‘米拉结薯对光照不敏感（崔翠等， 2001），散射光是诱导‘米拉结薯的最佳条件（赵佐敏， 2005）。本研究结果表明，在弱光4 h·d-1条件下进行结薯培养，成薯指数、薯块重量、大薯率、最大薯重、薯块直径均高于暗培养，这与光照可以延迟叶片衰老（Slimmon et al， 1989），不断地为试管薯的生长和发育提供能量有关。弱光4 h·d-1处理的试管薯在膨大期会超出液体培养基，因此采摘时的发芽率高，而黑暗条件下诱导的试管薯采摘时发芽率低，有休眠期，这与帅正彬等（2004）的研究结果一致。因此，利用这一特点，可以根据需要选择弱光或光照培养，需要立即播种的可以采用弱光诱导，需要贮藏、运输的试管薯，可以采用黑暗诱导。由于多数的试管薯着生在试管苗基部、少数着生在中上部，因此缩短节间的长度可以让更多的节间浸泡在诱导培养基中以产生更多的试管薯。本研究发现前期壮苗采用500 mg·L-1 CCC处理，可以使后期试管薯的成薯指数、最大薯重分别增加29.72%和14.71%。体积大的试管薯具有较高的发芽率，可以获得整齐一致的幼苗，0.5 g以上的试管薯可以作为“种子”（Park et al， 2009）直接用于生产，因此试管大薯的培养十分重要。

本研究得出马铃薯‘米拉“固液双层”培养法在试管苗壮苗培养及结薯诱导阶段培养基的配方及培养条件，获得了较高的成薯指数、薯块重量、大薯率和薯块直径，为该品种及其他马铃薯主栽品种的种薯快繁提供技术参考，有重要的科学及应用价值。

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