RAPD分子标记技术在大豆育种中的应用

林文磊 吕美琴 李明松 康蓉蓉 曾红英 姚文 蔡锦玲 叶玉珍

摘 要： 为了更好地引导分子标记技术应用到大豆辅助育种当中，综述了RAPD分子标记技术在大豆遗传多样性分析、抗病基因研究、农艺性状研究中的应用，旨在为把该技术应用于辅助培育高产、高蛋白质含量的大豆新品种提供理论依据及指导。

关键词： RAPD分子标记;大豆育种;高蛋白

DOI：  10.13651/j.cnki.fjnykj.2018.09.015

Application of RAPD Molecular Markers on Soybean Breeding

LIN Wen-lei1， LV Mei-qin1， LI Ming-song1， KANG Rong-rong1，ZENG Hong-ying1， YAO Wen1， CAI Jin-ling1， YE Yu-zhen2

（1. Quanzhou Institute of Agricultural Sciences， Quanzhou， Fujian 362212;2. Chengjiao Town Agricultural Technique Extension Station of Mingxi County， Sanming， Fujian 365200）

Abstract：  In order to apply the technique of RAPD molecular markers in assisted breeding of soybean， the paper reviewed the application of RAPD molecular markers technique in genetic diversity analysis， diseases-resistant genes investigation and agronomic characters of soybean so as to provide theoretical basis and guidance for application of RAPD molecular markers in assisted breeding of high yield， high protein content soybean varieties.

Key words：  RAPD molecular markers; soybean breeding; high protein content

大豆Glycine max（L.） Merrill起源于我國，是重要的粮食和经济作物，也是重要的饲料和轻工业原材料。随着生活水平的不断提高，人们越来越注重饮食健康，大豆成为获取植物蛋白及食用油的重要来源之一[1] 。然而，目前我国的大豆存在产量较低、品质较差等缺点，无法满足国内逐年增长的大豆需求，导致大豆进口量逐年增加，而进口大豆主要为转基因大豆。因此，非常有必要大力发展国产的优质非转基因大豆，主要是在提高大豆产量、改善品质、增强抗性、缩短育种年限等方面下功夫[2] 。

育种的本质就是将尽量多的优良性状集中于同一个品种上。传统的育种依赖于植株表型的选择，易受环境条件影响，具有周期长、预见性低等缺点。近年来，植物生物技术迅速发展，分子生物技术弥补了传统育种方法的不足，PAPD分子标记技术具有简单、便捷等优点被广泛应用于大豆辅助育种工作之中，提高了育种效率[3] 。

1 RAPD技术简介

分子标记辅助选择（Molecular-marker Assisted Selection，MAS）是利用分子标记与目标性状基因紧密连锁或共分离的特性，通过检测分子标记，间接检测目标基因的存在，从而达到选择有目标性状的个体，它不受个体生育期阶段、环境条件、器官组织差异等的影响，也不受基因表达与否的限制，选择目标个体更加准确、可靠[4-6] 。

RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA）是一种在PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）技术的基础之上，以不同个体基因组DNA作为模板，以一系列随机排列的十碱基寡脱氧核苷酸单链为引物，在特定的条件下进行扩增，经凝胶电泳获得多态性谱带，进而分析不同个体间的差异的分子技术[7] 。该技术可对完全未知任何分子生物学资料的物种基因组DNA进行分析，一套引物可用于不同生物的研究，具有简便、快速、成本低、灵敏度高、所需DNA模板量少等优点，对于研究亲本材料的遗传背景、选配杂交亲本具有较高的可靠性[8] 。

2 RAPD技术在大豆研究中的应用

2.1 遗传多样性分析

生物遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，是生物遗传信息的总和。对遗传多样性的研究可以了解物种的起源、种源的适应性、基因资源分布等问题[9] 。丰富的大豆种质资源是选育优良大豆品种的物质基础，研究大豆种质资源的遗传多样性，可为大豆选育工作提供理论依据。

张志永等[10] 对28份栽培大豆种质资源进行RAPD分析，结果表明聚类分析结果与种质资源间的亲缘关系、地理分布相吻合。陈艳秋等[11] 对146份大豆材料进行RAPD分析，结果表明供试大豆材料相互间的遗传距离介于0.703～0.959，可聚成3类。周延清等[12] 对10份河南栽培大豆品种进行RAPD分析，结果表明这些品种间的遗传相似系数介于0.528～0.776，可聚成3类。王振东等[13] 对45份不同抗旱程度的大豆种质资源进行RAPD分析，研究表明45份大豆种质间的遗传相似系数介于0.381 8～ 0.903 8 ，在遗传距离为0.38处，可聚为3大类，聚类结果表明品种间关系与表型形态、地理起源等具有一定的相关性。

2.2 抗病基因研究

大豆病害往往会严重影响大豆产量和品质，有些病害甚至会造成大豆绝产，而培育和种植抗病大豆品种是预防大豆病害最安全、经济、有效的途径[14-15] 。随着分子标记技术的快速发展，已经鉴定出很多与大豆抗某种病害的基因紧密连锁的标记。

大豆花叶病毒病（Soybean mosaic virus，SMV）是大豆的一种世界性病害，会导致减产及种子质量退化。目前，关于大豆抗SMV是由几对基因控制的，是显性基因还是隐性基因，亦或是显性基因和隐性基因共同控制的，这些问题尚无定论[14，16-19] 。国外学者已命名了4个抗SMV基因位点：Rsv1[20] 、Rsv2[21] 、Rsv3[22] 和Rsv4[18] 。通过分子标记技术已经发现很多与抗SMV基因连锁的标记，包括与Rsv1紧密连锁的RFLP、SSR、AFLP標记[23] ，与Rsv3紧密连锁的RFLP标记[24] ，与Rsv4紧密连锁的RFLP、SSR标记。张志永等[25] 研究表明，对大豆SMV强毒株系Sa的抗性由单显性基因Rsa控制，并获得2个重复性较好的RAPD标记OPW05 660bp  和OPAS06 1800bp  ，它们与该基因的连锁距离分别为22.2 cM和10.1 cM。东方阳[26] 的研究结果表明，特异RAPD标记与抗SMV毒株系Sa、Sc有关的抗性基因的连锁距离分别为16.1 cM和9.7 cM。吴俊江等[27] 的研究获得8个可能与抗SMV1号株系的抗性基因连锁的RAPD标记。郑翠明等[19] 的研究获得与抗SMV3号株系的基因紧密连锁的共显性RAPD标记OPN11 980bp/1070bp  ，遗传距离为2.1 cM。刘丽君等[28] 对黑农39（高抗）×合丰25（高感）的F 2群体进行RAPD分析，获得与抗病基因连锁的共显性标记OPN 1400bp/1300bp  ，连锁距离为8.2 cM。

大豆孢囊线虫病（Heterodera glycines Ichinohe，SCN）又称大豆根线虫病、黄萎症，目前，在我国主要有1、2、3、4、5、6、7、9和14号生理小种[29-30] 。章彦等[31] 的研究获得5个与SCN抗性密切相关的特异RAPD片段，分别为BRC173 1600bp  、BRC182 900bp   、BRC185 800bp  、BRC 185 850bp  、BRC190 1300bp  。 王慧等[32] 的研究获得1个与SCN抗性有关的RAPD标记S11 700bp  。王永军等[33] 以经过抗性遗传分析的BC 1F 2分离群体为材料，发现1个与SCN1号生理小种抗性基因连锁的RAPD标记OPA19 1200bp  。Skorup ska[34] 和Mahalingam[35] 的研究分别获得17个和4个与抗SCN3号生理小种的基因紧密连锁的RAPD标记。颜清上等[36] 以6份高抗SCN和2个高感SCN的大豆种质资源为材料，进行RAPD分析，引物OPG04扩增出1条只有抗病资源特有的特异DNA条带，推测这段DNA可能与抗SCN4号生理小种的抗性有关。Choi等[37] 的研究获得抗SCN3、5、14号生理小种的RAPD标记。

大豆灰斑病（Frog-eye leaf spot，FLS）是一种由大豆灰斑病菌Cercospora sojina引起的世界性病害，在我国黑龙江省发生最为严重。现已确定3个显性抗病基因Rcs1、Rcs2、Rcs3。目前，我国已鉴定的大豆灰斑病菌生理小种有11个[38] 。邹继军等[39-40] 通过研究东农91212（感C.sojina 7号生理小种）×东农9674（抗所有生理小种）的抗性遗传分析，表明对7号小种的抗性由单显性基因控制，并命名为Rcsc7，研究获得3个RAPD标记OPQ12 500bp  、OPS03 620bp  、OPA04 1100bp  ，与该抗病基因的连锁顺序为OPQ12 500bp  Rcsc7 OPS03 620bp   OPA04 1100bp ，遗传距离分别为17.3、8.7、33.2 cM。武小霞[41] 的研究获得1个显性RAPD标记OPC08 831bp  ，该标记与Rcsc7基因的遗传距离为25.59cM。董伟等[42] 对东农87 104（高感品种）× 东农9674（高抗品种）的F 2群体进行RAPD分析，研究结果获得与C.sojina 1号生理小种紧密连锁的3个特异标记：OPK03 840bp  、OPM17 1700bp  、OPO10 950bp  ，与抗病基因Rf1的连锁顺序为OPK03 840bp    Rf1 OPM17 1700bp   OPO10 950bp  ，遗传距离分别为：10.4、13.8、26.1 cM。

大豆疫霉根腐病（Phytophthora Root Rot，PPR）是由大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）引起的一种土壤性病害，在大豆整个生育期中都能侵染并造成大幅度减产。现已报道的16个抗大豆PPR的基因，分布于9个不同的位点上，9个不同的连锁群上[43-47] 。Bhattacharyya等[48] 对近等基因系（Willoams和William82）进行RAPD分析，结果表明，特异引物OPRK15与大豆PPR抗性基因Rps1 k紧密连锁。曲娟娟等[49-51] 以大豆PPR（Phytophthora megasperma）2对近等基因系（Williams与Williams79、Williams与Williams82）为材料，对其基因组DNA进行RAPD分析，研究结果推测，显性RAPD标记OPQ04 700bp  、OPH05 1600bp/640bp  分别与大豆PPR抗性基因Rps1 c 、Rps1 k 连锁。Byrum等[52] 的研究结果表明，特异RAPD标记OPB11 861bp  与抗性基因Rps4紧密连锁。

2.3 农艺性状研究

一个优良的大豆品种除了应该具备抗病性，还应该同时有一些好的农艺性状，例如产量高、油脂含量高、分支数多、单株荚数多、抗干旱、耐盐等。

刘昭君等[53] 对黑农小粒豆（低油）与垦农18（高油）的杂交F 2、F 3群体进行RAPD分析，找到4个与高油含量相关的特异DNA标记S56 900bp  、S61 600bp  、S107 600bp/450bp/370bp 、S134 450bp/500bp ，这些标记的重复性好，可用作鉴定大豆高油含量的分子标记。王慧等[54] 对12份黄色种皮和11份黑色种皮的大豆种质资源进行RAPD分析，发现了一个与大豆黄色种皮相关的特异DNA片段S79 500bp  ，而且该标记具有较高的重复性和稳定性，可用于辅助选择优良的黄色种皮大豆新品种。黄方等[55-56] 的研究表明RAPD标记S1 1900bp  与控制大豆短叶柄的基因的遗传距离为14.36 cM，标记S506 1500bp  与控制大豆曲径的基因的遗传距离为6.94cM。朱保葛等[57] 对经过烷化剂EMS诱变处理得到的4粒荚和窄叶稳定突变系E182进行RAPD分析，研究结果表明，特异标记OPY5 1300bp  与窄叶突变基因的遗传距离为8 cM。黄福龙[58] 以62对大豆细胞质雄性不育系及相应保持系为材料，用11个随机引物对其mtDNA进行RAPD分析，通过对特异片段的分析推断，大豆细胞质雄性不育可能与Cox I基因及其上游调控序列的插入和缺失有关。

3 存在的问题及展望

我国大豆种质资源极其丰富，栽培地区遍布全国各地。大豆栽培种的形态与经济性状受地理位置、地域气候、土壤、光照等自然条件的影响，仅仅根据大豆的经济性状与形态进行分类，有可能造成将不同基因型误归为同一品种，或将同一基因型误归为不同品种的结果。与传统育种方法相比，RAPD分子标记技术具有简单、便捷等优点，在保证DNA纯度，并严格控制PCR反应条件的前提下，其重复性高，可获得清晰稳定的电泳条带，可用于大豆分子研究分析，这为辅助挑选优质的大豆亲本提供理论依据，可大大缩短育种年限并提高选择准确率。

目前，我国在生产上缺乏高蛋白含量的大豆品种，迫切需要利用分子辅助育种技术改良现有的大豆品种，以期选育出高产、高蛋白的优良大豆新品种。关于大豆蛋白质方面的研究主要集中在蛋白质品质、结构、含量等[59-60] 方面，而应用于大豆蛋白研究中的分子标记技术，主要有利用SSR[60-65] 、RFLP[66-67] 、SNP[68-69] 技术进行分析，RAPD在蛋白质含量方面的研究仍未见报道。

RAPD分子标记技术是一种显性标记，无法确定所研究的个体是纯合体还是杂合体，同时，由于引物序列短，退火温度较低，该标记容易受PCR扩增时的温度影响，可将其转化为SCAR（Sequence Characterized amplified regions，特定序列扩增）标记，克服RAPD标记的缺陷，提高目标性状基因检测的准确性，从而达到高效地辅助选择育种的目的。

后续将挑选高蛋白含量与低蛋白含量的大豆种质资源，利用RAPD技术进行分析，期望能找到与大豆蛋白质含量相关的特异RAPD标记，以辅助选择高蛋白含量的大豆种质，缩短育种年限。

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