基于低共熔溶剂提取千斤拔多糖

熊苏慧 夏伯候 雷思敏 李诗卉 谢明霞 李亚梅 林艳

〔摘要〕 目的 采用一种新型绿色溶剂低共熔溶剂（deep eutectic solvents， DESs）提取千斤拔多糖，并对其提取工艺及提取效率进行考察。方法 采用响应面法，优化千斤拔多糖提取工艺，并以水提醇沉法评价DESs提取效率。结果 由氯化胆碱和1，3-丁二醇合成的低共熔溶剂最适合于千斤拔多糖的提取。经响应面法优化后，在提取温度70 ℃、水比例11%、提取时间41 min、液固比11 mL/g下，千斤拔多糖提取率可达2.47%，显著高于水提醇沉后所得多糖（P<0.05）。结论 低共熔溶剂作为提取介质具有高效和绿色的优点，可用于千斤拔多糖的提取，同时本结果为DESs提取中药活性成分提供新思路。

〔关键词〕 低共熔溶剂；响应面法；千斤拔；多糖

〔中图分类号〕R284.2 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.09.008

〔Abstract〕 Objective To investigate the extraction of polysaccharides from Moghania macrophylla using new green deep eutectic solvents （DESs） and related extraction process and extraction efficiency. Methods The response surface method was used to optimize the extraction process for polysaccharides from Moghania macrophylla， and the water extraction and alcohol precipitation method was used to evaluate the extraction efficiency of DES. Results The DESs composed of choline chloride and 1，3-butanediol was most suitable for the extraction of polysaccharides from Moghania macrophylla. After optimization with the response surface method， an extraction temperature of 70 °C， a water ratio of 11%， an extraction time of 41 minutes， and a liquid-solid ratio of 11 ml/g achieved a yield of polysaccharides from Moghania macrophylla of 2.47%， which was significantly higher than the yield obtained by water extraction and alcohol precipitation （P<0.05）. Conclusion DESs has the advantages of high efficiency and being environment-friendly as an extraction medium and can be used for the extraction of polysaccharides from Moghania macrophylla. Meanwhile， the results of this study provides new ideas for the use of DESs in the extraction of active components of traditional Chinese medicine.

〔Keywords〕 deep eutectic solvent； response surface method； Moghania macrophylla； polysaccharide

中药千斤拔Moghania macrophylla （WiWd.） O. Kuntze.含有多糖、黄酮、生物碱、β-谷甾醇等多种活性成分，具有祛风除湿、强筋壮骨、活血解毒的功效[1]。其中千斤拔多糖类成分具有提高免疫力的作用[2]，可广泛用于食药品行业，因此，如何千斤拔中高效提取多糖具有重要意义。

近年来，“绿色化学”的提出促使离子液体（ionic liquids， ILs）、低共熔溶剂（deep eutectic solvents， DESs）等绿色溶剂的发展。随着研究的进行，ILs表现出高成本、潜在毒性和较差的可生化性等不足[3-4]，而DESs因其低成本、易合成、生物可降解性、高增溶作用、低毒性甚至非毒性等优势已成为科学研究的新宠。DESs由氢键受体（HBA）和氢键供体（HBD）组成，其熔点低于各个组成部分[5]，现已广泛用于黄酮[6]、酚酸[7]、生物碱[8]等中药活性成分的提取，但在多糖[9]提取方面却相对较少。

因此，本研究选择合适DESs提取千斤拔多糖，并利用Box-Behnken设计对千斤拔多糖的提取条件（温度、时間、水比例、液固比）进行系统优化，筛选最佳提取条件，为今后DESs的研究及千斤拔多糖的合理利用提供科学依据。

1 仪器与材料

千斤拔由千金药业提供，经湖南中医药大学药学院龚力民副教授鉴定为豆科植物大叶千斤拔Moghania macrophylla （WiWd.） O. Kuntze.的干燥根。

超声波清洗器（KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司）；电子分析天平（CP114，奥豪斯仪器（上海）有限公司）；酶标仪（SN-268393，美国伯腾仪器有限公司）等；用于合成DESs相关试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。

2 方法

2.1 前处理

千斤拔样品在40 ℃下干燥2 h至恒重，粉碎并过筛（80目），备用。HBD和HBA（氯化胆碱）在80 ℃下加热搅拌，直至形成均匀的液体[7]。DESs组成如表1所示。

2.2 千斤拔多糖的提取

精密称量千斤拔药材粉末1.00 g置于离心管中，加入DESs 22 mL（含蒸馏水为11%），混合均匀，充分浸泡后，于70 ℃下恒温超声41 min，随后溶液冷却至室温并补足重量，溶液转移至离心管内，离心30 min（3 000 r/min），取上清液4 mL置于离心管中，加入无水乙醇16 mL，静置12 h后离心30 min （3 000 r/min），挥干乙醇溶液，加入蒸馏水4 mL，摇匀，离心（3 000 r/min）30 min，取出上清液，弃沉淀，即得千斤拔多糖粗提液。

2.3 标准品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的葡萄糖15.0 mg，置25 mL的容量瓶中，加入蒸馏水溶解并定容至刻度，配制成浓度为0.6 mg/mL的葡糖糖对照品溶液。然后分别吸取此对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，即得。

2.4 最大吸收波长的确定

取上述“2.3”项的标准品溶液，用苯酚-硫酸法显色，在波长400～800 nm下进行光谱扫描，测得最大吸收波长在490 nm处。

2.5 标准曲线的制备

精密称取“2.3”的标准品溶液各1 mL，加入浓度为4%的苯酚溶液5 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸2.5 mL，在90 ℃水浴下加热5 min，冷却至室温，在490 nm波长处测定吸光度。以1 mL蒸馏水按同样显色操作为空白，横坐标为标准品溶液，纵坐标为吸光度值，绘制标准曲线，得回归方程：

A=0.010 7C+0.148 6，r=0.999 8（n=6）。

2.6 多糖含量的计算

精密称取千斤拔多糖粗提液200 μL，加蒸馏水至1 mL，按“2.5”方法测定多糖吸光度值。将吸光度值代入标准曲线查得对应的多糖质量浓度（μg/mL），再利用如下公式得到千斤拔多糖的提取率。

Y（%）=CVD/（M/1000 000）×100%

式中：Y（%）为千斤拔多糖的提取率；C为与标准曲线查得的多糖质量浓度（μg/mL）；V为总提取液的体积（mL）；D为稀释倍数；M为样品质量（g）。

2.7 不同DESs及提取方法考察

考察5种不同DESs（摩尔比1∶2），寻找最佳DESs后，考察6个不同摩尔比（1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7），选择多糖提取率最大者作为最佳DESs。同时对4种不同提取方法（常温搅拌、常温超声（P=79 W）、加热搅拌（T=50 ℃）和加热超声（T=50 ℃、P=79 W）进行考察。

2.8 单因素考察

在最佳DESs和提取方法下，考察不同提取温度（20、30、40、50、60、70、80 ℃）、水与溶剂比（以下简称水比例）（0%、20%、40%、60%、80%）、提取时间（20、30、40、50、60 min）、液固比（5.5、8.0、11.5、15.0、18.5 mL/g）对多糖提取率的影响，选择最佳条件进行Box-Behnken（BBD）实验设计。

2.9 实验设计

采用三水平四因素BBD设计寻找千斤拔多糖提取条件最优组合。选取提取温度（X1），水比例（X2）、提取时间（X3）和液固比（X4）因素中影响最大的三水平，分别以-1、0、1编码，因素与水平设计见表2。建立BBD模型方程式：

其中y为千斤拔多糖提取率；Xi、Xj为不同的因素；bo、bi、bii、bij分别为回归方程的截距、单因素系数、二次项系数和因素交叉系数。

2.10 统计学方法

计量数据用“x±s”表示，响应曲面模型的回归方程式和显著性统计用Design Expert 8.0.6软件进行计算和分析，其中P<0.05具有显著性差异，P<0.01具有极显著性差异。模型的准确性及显著性由F值、回归系数R2和失拟项决定，R2越接近1，模型越可靠。

3 结果和讨论

3.1 不同DESs及提取方法对多糖提取率的影响

3.1.1 不同种类DESs对多糖提取率影响 扩散度、溶解度、黏度、表面张力、极性和醇基位置等条件是DESs提取活性成分的重要因素[10]。探讨5种DESs在加热（T=50 ℃、t=30 min）条件下对千斤拔多糖提取率的影响，结果如图1（a）所示。多糖提取率大小排列顺序为：DESs-4>DESs-2>DESs-5>DESs-1>DESs-3，其中DESs-4多糖提取率高达1.53%，主要原因为：溶剂黏性和表面张力小，1，3-丁二醇内部空间足够大且醇基分支少，且极性更适合多糖提取。

3.1.2 HBA与HBD不同摩尔比对多糖提取率影响 HBA与HBD之间摩尔比值降低，DESs的黏度和表面张力也随着减低，可以增加多糖提取率。但比值过度的降低则会导致氯化胆碱浓度降低，从而影响多糖提取率。因此，选用合适的比值对多糖的提取效率具有很大的影响。考察DESs-4不同摩尔比（1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6）對多糖提取率的影响，结果如图1（b）所示。摩尔比从1∶2到1∶6的增加过程中，多糖提取率先增后减，在1∶5时，达最大值1.75%。

3.1.3 不同提取方法对多糖提取率影响 本实验研究常温搅拌、常温超声（P=79 W）、加热搅拌（T=50 ℃）和加热超声（T=50 ℃、P=79 W）4种不同提取方法对千斤拔多糖提取率的影响。结果如图1（c）所示，加热超声提取（1.76%）均比搅拌提取（0.51%）、加热搅拌提取（1.36%）和常温超声提取（1.22%）的多糖提取率高。说明超声和温度均能影响DESs对多糖的提取效率。

3.2 单因素实验结果

3.2.1 不同提取温度对多糖提取率的影响 适当的增加温度能降低DESs的粘度、增加扩散系数，破坏分子间的相互作用，从而提高活性物质的溶解[11]。固定其余条件，考察DESs在不同温度梯度下（20、30、40、50、60、70、80 ℃）对多糖提取率的影响，结果如图2（a）所示。多糖提取率随着温度的升高，在60 ℃时达到最大值1.80%，之后温度的升高对提取率变化不大且有降低趋势。因此，确定60 ℃为最佳提取温度。3.2.2 不同水比例对多糖提取率的影响 水比例是影响DESs提取效率的另一重要参数，具有调节DESs黏度和极性作用[12]。固定其余条件，考察DESs在不同水比例梯度（0%、20%、40%、60%、80%）对多糖提取率的影响，结果如图2（b）所示。随着水比例增加，多糖提取率先增后降，在20%处可达最大值2.01%。因此，确定20%为最佳水比例。

3.2.3 不同提取时间对多糖提取率的影响 提取时间对多糖提取率有着重要的影响，研究表明[13]，在一定时间段内，活性成分溶出率随着时间的增加而增加，然而达到一定时间后，溶液体系渗透压达到平衡时溶出率变化不大。固定其余条件，考察DESs在不同时间梯度（20、30、40、50、60 min）对多糖提取率的影响，结果如图2（c）所示。多糖提取率随着提取时间的增加在40 min达最大值2.19%，后期的超声过程中，杂质的析出对多糖提取率产生了影响。因此，确定40 min为最佳提取时间。

3.2.4 不同液固比对多糖提取率的影响 DESs的含量决定了药材是否能充分浸润、目标化合物能否有效溶出，因此考察液固比对多糖提取率具有重要作用。固定其余条件，考察DESs在不同液固比梯度（5.5、8.0、11.5、15.0、18.5 mL/g）对多糖提取率的影响，结果如图2（d）所示。随着液固比的增加，多糖提取率不断增加最大可达2.31%，再次增加液固比对提取率影响不大。因此，确定11.5 mL/g为最佳液固比。

3.3 响应面（RSM）优化提取条件结果分析

3.3.1 统计分析和模型拟合 本实验采用的BBD设计涉及到3个水平、4个因素，具有5个重复用于评价数据变异性和稳定性。BBD表格设计及其实验数据如表3所示。对数据进行分析，回归方程为：

Y=-5.726 93+0.111 1 X1+0.145 29 X2+0.060 793 X3+0.442 64 X4-1.312 5×10-3 X1X2-7.5×10-5 X1X3-2.071 43×10-3 X1X4-1.625 2×10-4 X2X3-1.821 43×10-3 X2X4+1.857 14×10-3 X3X4-8.966 67×10-4 X12-1.180 42×10-3 X22-1.034 17×10-4 X32-0.029 463×10-4 X42

由表4可知，模型因变量和全体自变量之间的线性关系显著（R2=0.995 6），且P值小于0.01，方程的失拟项P值为0.959 9，R2Pred与R2Adj差异值小于0.2，精密度大于4，以上结果证明该模型可靠。一次项X1、X2和X4，交互项中的X1X2、X2X4以及二次项中的X12、X22、X32、X42对千斤拔多糖提取率的影响极为显著（P<0.01）；X1X4、X3X4对千斤拔多糖提取率的影响显著（P<0.05）。

3.3.2 RSM分析 响应面三维图和等高线图被不仅可以解释自变量之间的相互作用，而且可以反映变量间相互作用。通过观察曲面的倾斜度确定两者对响应值的影响程度，倾斜度越高，即坡度越陡，说明两者交互作用越显著。提取温度（X1）、水比例（X2）、提取时间（X3）和液固比（X4）对千斤拔多糖提取率的影响如图3所示，四因素之间的交互曲面均具有较大的倾斜度，说明两两因素之间对千斤拔多糖提取率的影响较大。曲面图结果与表4方差分析结果相符合（P<0.01）。因此，X1=70.00 ℃、X2=11.38%、X3=40.82 min、X4=10.91 mL/g时，千斤拔多糖提取率达到最大预测值2.51%。为了实验便利性，对4个因素实验值进行适当修饰如下：X1=70 ℃、X2=11%、X3=41 min、X4=11 mL/g。利用改进后的最优条件进行实验验证，实验结果显示多糖提取率为（2.47±0.03）%，与预测值无明显差异性（P>0.05）。

3.4 传统方法提取千斤拔多糖

目前文献报道的千斤拔多糖提取方法主要为水提醇沉法。为评判DESs提取千斤拔多糖效率，本研究将两者进行对比。采用文献报道的最佳工艺[14]，在提取温度70 ℃、超声时间30 min、液固比40 mL/g、提取时间2 h下，千斤拔多糖提取率为（1.32±0.09）%，显著低于DESs最优条件下多糖提取率（2.47%，P<0.05）。

4 结论

本研究采用了一种新型绿色溶剂—低共熔溶剂（DESs）提取千斤拔多糖。在初步筛选单因素实验的基础上，采用BBD设计进一步优化条件，发现在最优条件下，实际千斤拔多糖提取率在预测范围之内。 此外采用DESs提取千斤拔多糖优于水提醇沉法。因此，DESs作为溶剂用于千斤拔多糖的提取，科学可行、高效环保。本研究的完成可为DESs提取植物多糖提供理论基础以及有利于千斤拔的进一步开发研究。

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（本文编辑 苏 维）