肺动脉高压大鼠肺组织中TGF拨1和IL6的表达水平及意义

邓凯 邹勇 廖志新 郑常龙

【摘要】目的研究轉化生长因子β1（TGFβ1）和IL6在野百合碱诱导的肺动脉高压（PAH）大鼠肺组织中的表达水平及意义。方法22只雄性SD大鼠随机分为正常对照组（n=6）、野百合碱3周组（MCT3w组，n=8）和MCT5w组（n=8），皮下注射野百合碱复制肺动脉高压模型。检测右心室收缩压（RVSP）和右心室肥厚指数（RVHI），左肺组织经固定包埋切片后行van Geison染色，光镜下观察肺内小动脉病理改变，计算肺内小动脉血管壁厚度占血管直径的百分比（WT%）和血管壁面积占小动脉总横截面积的百分比（WA%）。蛋白免疫印迹法检测右肺组织TGFβ1表达水平，ELISA检测肺组织中IL6表达水平。 结果与正常对照组相比，MCT3w组和MCT5w组大鼠的RVSP和RVHI均升高（P<005），肺小动脉中膜增厚，WT%和WA%均增加（P均<005），肺组织中TGFβ1和IL6表达水平均上调（P均<005）；与MCT3w组相比，上述指标在MCT5w组增高更明显（P均<005）。 结论TGFβ1和IL6在野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠肺组织中的表达水平均增高，TGFβ1和IL6可能参与了PAH的发病和进展。

【关键词】转化生长因子β1；白介素6；肺动脉高压；野百合碱

Expression level and significance of transforming growth factorβ1 and interleukin6 in lung tissues of rats with pulmonary hypertensionDeng Kai， Zou Yong， Liao Zhixin， Zheng Changlong Institute of Infectious Diseases， the Eighth Peoples Hospital of Guangzhou， Guangzhou Medical Univevsity， Guangzhou 510060， China

Corresponding author， Zheng Changlong， Email： zhengchanglong@163com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression level and significance of transforming growth factorbeta 1（TGFβ1） and interleukin6 （IL6）in the lung tissues of rat models with pulmonary hypertension induced by monocrotaline MethodsTwentytwo male SD rats were randomly divided into the normal control group（n=6）， 3week monocrotaline group（MCT3w group， n=8）and 5week monocrotaline group（MCT5w group， n=8） Pulmonary hypertension rat models were established by subcutaneous injection of monocrotaline The right ventricular systolic pressure（RVSP）and right ventricular hypertrophy index（RVHI）were measured The left lung tissue sections were stained with van Geison staining The pathological changes of the pulmonary arterioles were observed under optical microscope The percentage of wall thickness （WT%） of pulmonary arterioles to the vascular diameter and wall area （WA%） to the total crosssectional area of pulmonary arterioles was calculated The expression level of TGFβ1 in the right lung tissues was quantitatively detected by Western blot The concentration of IL6 in the lung tissues was measured by ELISA ResultsCompared with the normal control group， the RVSP and RVHI were significantly elevated （both P<005）， the middle membrane of pulmonary arterioles was considerably thickened， the WT% and WA% were significantly increased （both P<005） and the expression levels of TGFβ1 and IL6 in the lung tissues were evidently upregulated （both P<005） in the MCT3w group and MCT5w group Compared with the， the parameters above were significantly increased in the MCT5w group （all P<005） ConclusionsThe expression levels of TGFβ1 and IL6 are significantly upregulated in the lung tissues of rats with pulmonary hypertension induced by monocrotaline TGFβ1 and IL6 may be involved in the pathogenesis and progression of pulmonary hypertension

【Key words】Transforming growth factorbeta 1； Interleukin6； Pulmonary hypertension；

Monocrotaline

肺动脉高压（PAH）是一种严重的进展性疾病，其主要病理生理特征为肺内小血管管腔缩窄、重构导致肺血管阻力进行性增高，甚至右心衰竭和死亡[12]。PAH的发病与多种因素有关，至今仍未完全阐明[12]。近年多项研究显示，PAH的发病可能与多种炎症因子有关[3]。野百合碱是一种生物碱，由于其诱导产生的PAH与人类特发性PAH最为接近而被广泛应用于建立PAH的动物模型[4]。本研究将在野百合碱诱导的大鼠PAH模型中观察TGFβ1和IL6表达情况，并探讨其意义。

材料与方法

一、实验动物和材料

本实验所用的雄性SD大鼠（7周龄，体质量220～250 g）由中山大學实验动物中心提供，并饲养于该中心SPF级动物房。饲养环境为恒温（22±2）℃，恒湿（55±5）%，每日照明12 h，自由饮水、进食。野百合碱购自美国Sigma公司；TGFβ1和GAPDH抗体购自美国CST公司；IL6 ELISA试剂盒购自美国Abcam公司。本动物实验经中山大学实验动物伦理委员会批准，并根据中山大学动物实验中心的实验动物操作标准进行。

二、动物分组和建立模型

使用随机数字表法将22只雄性SD大鼠分为3组：正常对照组（n=6）、野百合碱3周组（MCT3w组，n=8）和野百合碱5周组（MCT5w组，n=8）。其中，MCT3w组和MCT5w组大鼠分组后一次性经腹部皮下注射野百合碱60 mg/kg建立PAH模型，正常对照组皮下注射生理盐水60 mg/kg作对照。MCT3w组在野百合碱注射3周后到达实验终点，MCT5w组和正常对照组在野百合碱注射5周后到达实验终点。

三、右心室收缩压（RVSP）和右心室肥厚指数（RVHI）的测定

大鼠称重后，腹腔内注射戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉，并将大鼠固定于小动物手术台，游离出右侧颈外静脉，远心端用手术线结扎，显微手术剪剪开颈外静脉1/3，将已充盈肝素钠的聚乙烯导管（PE100）从右颈外静脉插入，经上腔静脉、右心房插入右心室，导管连接换能器，通过PowerLab生物信号采集系统，待波形稳定后记录RVSP。处死大鼠后分离大鼠心脏，剪去左、右心房及大血管根部，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗干净后将心室剪为右心室游离壁（RV）和左心室加室间隔（LV+S）2部分，分析天平称重后计算两者的比值即为右心室肥厚指数[RVHI= RV/（LV+S）]。

四、肺小动脉形态学观察

游离出大鼠肺脏，4 ℃ PBS反复冲洗，右肺组织经液氮冷冻后迅速转至-80℃冰箱冻存备用。剪取左下肺组织（厚度约05 cm），PBS冲洗干净后放入4%多聚甲醛中固定12 h，分别经50%、75%、95%、100%乙醇脱水、浸蜡、包埋，切片行van Geison染色，在光学显微镜下观察肺内小动脉的病理改变，先在低倍镜下挑选，然后在高倍镜下选择直径在50～100 μm的肺小动脉拍照并分析。每张切片选取15～20根肺小动脉，运用图像分析软件分别测量肺内小动脉的血管壁厚度（WT）、血管直径（ED），并计算血管壁厚度占血管直径的百分比（WT%）、肺内小动脉的环形血管壁面积（LA）占小动脉总横截面积（TA）的百分比（WA%）。WT%和WA%按以下公式计算：WT（%）=2×WT/ED×100%；WA（%）=（TA-LA）/TA×100%。

五、肺组织中TGFβ1表达水平检测

取约50 mg右肺组织，加入400 μl组织蛋白裂解液，在研磨器中充分研磨、4 ℃静置30 min，4℃ 12 000转/分高速离心后提取总蛋白质。测定蛋白浓度后，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法将等量蛋白质进行分离并转移至PVDF膜上，用含10 g/L小牛血清白蛋白的TBST溶液封闭2 h后，分别加入抗TGFβ1和GAPDH抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜。TBST溶液洗涤后加入二抗稀释液（1∶8 000），轻轻摇动2 h后用TBST洗膜4次，最后用化学底物进行发光显迹。用IBAS图像处理系统对胶片进行扫描后应用Image图像分析软件分析各条带的灰度值进行比较。

六、肺组织中IL6表达水平检测

取约100 mg右肺组织加冰生理盐水1 ml制成100 g/L组织匀浆，用ELISA检测肺组织中IL6表达水平。

七、统计学处理

使用SPSS 190分析数据。计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析，多重比较采用LSDt检验。P<005为差异有统计学意义。

结果

一、各组大鼠的RVSP和RVHI比较

到达实验终点时，MCT3w组和MCT5w组分别有1只和2只大鼠死亡，正常对照组无大鼠死亡。与正常对照组相比，MCT3w组大鼠的RVSP和RVHI均升高（P均<005），表明PAH模型建立成功，而与MCT3w组相比，MCT5w组大鼠的RVSP和RVHI进一步升高（P均<005），见表1。

二、各组大鼠的肺内小动脉形态学比较

3组的WT%和WA%比较差异均有统计学意义（F值分别为25076和37883，P均<0001）。与正常对照组相比，MCT3w组大鼠的肺小动脉中膜增厚，WT%和WA%增加，而与MCT3w组相比，MCT5w组大鼠的肺小动脉中膜进一步增厚，WT%和WA%增加（P均< 005），见图1。

表1各组大鼠的RVSP和RVHI的比较（±s）组别nRVSP（mm Hg）RVHI正常对照组6168±18026±003MCT3w组7336±37a041±004aMCT5w组6421±50ab058±006abF值7151176671P值<0001<0001注：与正常对照组相比，aP<005；与MCT3w组相比，bP<005

三、各組大鼠肺组织TGFβ1表达水平比较

3组的TGFβ1表达水平比较差异具有统计学意义（F=128935，P<0001）。与对照组相比，MCT3w组大鼠肺组织中TGFβ1的表达上调，而MCT5w组大鼠肺组织中TGFβ1表达比MCT3w组进一步增加（P<005），见图2。

四、各组大鼠肺组织上清液中IL6表达水平比较

正常对照组、MCT3w组、MCT5w组大鼠肺组织上清液的IL6表达水平分别为（49±14）、（119±18）、（208±21）ng/L，3组的IL6表达水平比较差异有统计学意义（F=78864，P<

图1各组大鼠肺内小动脉的形态变化（van Geison 染色，×400）

A：正常对照组；B：MCT3w组；C：MCT5w组；D：各组WT%和WA%的比较；与正常对照组相比，*P<005；与MCT3w组相比，#P<005

图2TGFβ1在各组大鼠肺组织表达水平比较

A：蛋白免疫印迹法检测结果；B：扫描后光密度比值的比较；与正常对照组相比，*P<005；与MCT3w组相比，#P<005

0001）。与对照组相比，MCT3w组大鼠肺组织中IL6表达水平增加（P<005），而MCT5w组大鼠肺组织中IL6表达水平比MCT3w组进一步增加（P<005），见图3。

图3IL6在各组大鼠肺组织的表达情况

与正常对照组相比，*P<005；与MCT3w组相比，#P<005

讨论

野百合碱是一种生物碱，本身并无生物学活性，但其在体内经肝脏代谢后生成有活性的吡咯野百合碱，可使肺血管内皮细胞损伤、血管平滑肌异常增殖，从而导致血管重构和PAH[4]。本研究中，MCT3w组和MCT5w组大鼠与正常对照组相比，RVSP和RVHI均增高、肺小动脉中膜增厚，表明本研究的PAH模型已建立成功。TGFβ1和IL6在MCT3w组和MCT5w组肺组织中的表达水平均升高，而且在MCT5w组中升高更明显，提示TGFβ1和IL6可能参与PAH的发病，而且TGFβ1和IL6的表达水平与PAH的进展可能相关。

TGFβ1是一种多功能细胞活性调节因子，可通过各种受体和细胞外信号分子参与细胞的增殖、迁移和分化等活动[5]。越来越多的证据表明，TGFβ1信号通路异常与PAH的发病机制有关[6]。TGFβ1可通过调控多种信号通路抑制内皮细胞的凋亡、促进血管平滑肌细胞异常增殖、 增加细胞外基质沉积等过程，从而促进PAH的形成和发展[78]。相反，通过抑制TGFβ1及其下游信号分子的表达，可减缓血管平滑肌细胞的异常增殖、减少细胞外基质的沉积[9]。本研究进一步证实，随着疾病的进展和肺动脉压力的进一步增高，TGFβ1在肺组织中的表达也增多。由此可见，TGFβ1在PAH发生和发展中有重要作用，TGFβ1有望成为PAH治疗的新靶点。

IL6是由活化的T细胞和成纤维细胞产生的细胞因子，可通过介导炎症、促进血管平滑肌细胞增殖等机制在PAH发病中发挥重要作用[1011]。有研究者发现，在特发性 PAH患者血清和肺组织中IL6的表达增加[12]。本研究证实在野百合碱诱导的大鼠肺组织IL6水平显著增加，而且随着病程进展，IL6水平进一步增加。因此推测，IL6可能参与了PAH的发病及进展，通过降低肺组织IL6的浓度可能会降低肺动脉的压力，阻止PAH的进展。

综上所述，在野百合碱诱导的PAH模型中，大鼠肺组织中TGFβ1和IL6表达水平升高，TGFβ1和IL6可能参与PAH的发生和进展，有望成为PAH的治疗靶点。

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