上海地区玉米品种DNA指纹图谱采集及数据分析

姚丹青,楼坚锋,顾芹芹,刘 建,张 琪,夏建明∗

(1上海市种子管理总站,上海201103;2上海交通大学农业与生物学院,上海200240)

简单序列重复(Simple sequence repeat,SSR)标记是建立在PCR(Polymerase chain reaction)反应基础之上的一种遗传标记,相比其他常用技术具有稳定性好、准确性高等优点,已经被广泛运用于农作物品种鉴定中。辛景树[1]从DNA快速提取、引物筛选等技术环节进行系统研究,建立了完整的SSR技术体系,制作了国内192个玉米主推品种及亲本的DNA指纹图谱,并开展了玉米种子纯度与品种真实性鉴定的推广应用。随着社会经济的发展,鲜食玉米如糯玉米、甜玉米等的遗传改良及新品种选育工作得到高度重视,新品种不断涌现,种子市场异常活跃。近年来,鲜食玉米遗传育种及生产应用发展迅速,但分子标记技术在种质鉴定中的应用与普通玉米相比仍显落后。本试验利用DNA指纹图谱技术,通过选用一系列鲜食玉米SSR引物,对上海地区的32个鲜食玉米品种进行指纹标记,以期为当地玉米种子市场的品种管理提供一种快速、有效的鉴定方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用上海市2013年、2014年和2015年审定和生产上应用的鲜食玉米品种,共计32份(表1)。

表1 上海市鲜食玉米品种材料及来源Table 1 The materials and sources of 32 maize varieties in Shanghai

1.2 DNA提取和SSR引物筛选

所有试验材料均采集幼苗或叶片,使用北京天根生化公司植物新型基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取,并在1.0%的琼脂糖凝胶中进行电泳,检测DNA质量,电泳缓冲液为1×TAE,电压100 V;DNA纯度和浓度利用NanoDrop2000c紫外可见光谱仪(Thermo公司)进行测定,稀释至50 ng∕μL的工作液备用,4℃冰箱储藏。

SSR引物来源于2个方面：参考国内外发表的文献,选择具有多态性的引物;自行设计,根据数据库提供的SSR位点序列,利用引物设计软件PRIMER 5.0设计。初步确定40对引物用于初筛分析。所有引物由上海生工有限公司合成。

PCR 反应体系：HotStart Mix 2 × 10 μL,Coralload 10 × 2 μL,上下游引物各 0.6 μL,50 ng∕μL 模板1 μL,ddH2O 5.8 μL,总体积为20 μL。 PCR反应程序：94℃预变性5 min;94℃变性40 s,55—60℃退火35 s,72℃延伸45 s,36个循环;72℃延伸10 min,扩增产物4℃保存。

1.3 DNA指纹图谱的采集及数据分析

所有数据分析基于QIAxcel ScreenGel 1.4版软件,通过软件系统自动对指纹的原始数据进行分析,确定每个位点的等位基因。采用NTSYS-pcv 2.11软件进行聚类分析,构建分子系统树。

2 结果与分析

2.1 引物初筛

取表型差异较大的20个玉米品种作为引物初筛材料,对扩增产物进行电泳分析,根据电泳谱带分析结果(图1),筛选出具有一定多态性、扩增容易、扩增带型清晰且稳定的引物进行复筛。

2.2 引物复筛

以收集的所有玉米品种为材料,采用毛细管电泳系统对扩增产物进行检测分析。一是分析产物的峰型,淘汰一些连续多峰且主峰不稳定、高低峰不明、杂峰多等不容易分析的引物,保留较好峰形的引物(图2);二是统计每个位点等位基因数,并根据等位基因的频率计算位点的多态性信息含量(PIC),保留PIC大于0.5的引物;三是考虑引物染色体均匀分布,确保每条染色体上有1个位点。品种鉴定引物组合须满足3个要求：鉴别能力强(满足海量品种的鉴别),数量适宜(经济方便),染色体分布均匀(不连锁)。按照候选引物的PIC值以及所在的染色体进行排序,取每个染色体上PIC最高的引物作为组合基数,通过遗传聚类分析组合的鉴别能力,将收集的品种进行有效区分,最终确定适合玉米品种鉴定的候选引物25对(表2)。

图1 利用毛细管电泳系统检测引物多态性Fig.1 Detection of primer polymorphism by capillary electrophoresis

图2 复筛引物P15的峰型和等位基因分析Fig.2 Peak type and allele analysis of rescreened primer P15

表2 适合玉米品种鉴定的候选引物的确定Table 2 Determination of candidate primers suitable for identification of maize varieties

2.3 DNA数字指纹建立

以多态性高、重复性好、带型易区分统计的原则[2],确定了25对核心引物,将SSR-PCR扩增产物特征谱带进行0、1数字化,建立数据库。

表3 上海地区32个玉米品种DNA指纹数据Table 3 DNA fingerprintdata of 32 maize varieties in Shanghai

2.4 遗传多样性分析

图3 32个玉米品种25对引物组合的遗传聚类图Fig.3 Clustering map of 25 markers on 32 maize varieties

根据25对SSR引物的扩增结果进行遗传多样性分析,32个玉米品种的相似系数为0.460—0.900,在遗传相似系数为0.53时,可将32个玉米品种分为三大类群(图3)。其中,8(‘万彩糯3号’)、12(‘苏珍花糯2012’)、19(‘苏科糯3号’)、21(‘苏珍甜糯5 号’)、22(‘沪五彩花甜糯’)聚类到第2 类群,籽粒颜色都为花色相间。在遗传相似系数为0.64时,可将第2聚类群分为3组,第2组中的25(‘沪甜1301’)、26(‘先甜5 号’)、27(‘圣甜1 号’)、28(‘先甜90’)、29(‘沪甜1 号’)、32(‘金珠甜脆’)均为黄色籽粒、穗轴白色、花丝绿色;第3组中的10(‘申科糯1号’)、16(‘华耘黑糯501’)、15(‘天糯一号’)、20(‘荆恒一号’)、21(‘苏珍甜糯5号’)均为糯玉米。

3 讨论

主要农作物品种审定登记制度实施以来,审定品种的数量呈逐年增多趋势,截至2013年底,玉米审定品种数量达到6 291个[3],给品种高效管理带来了挑战;随着玉米品种资源遗传基础日趋狭窄及少数骨干亲本被集中应用,出现了一批在原品种基础上仅做细微改良的派生品种,对品种鉴定技术提出了更高的要求;市场上出现标签名称与实际包装的种子不符等品种真实性问题,增加了种子市场监管的难度[4]。目前,SSR标记技术在玉米、水稻等农作物中已有广泛运用。李新海等[5]利用SSR标记研究了21个玉米自交系的遗传变异。刘杰等[6]采用SSR标记和杂种优势聚类方法分析了中国15个玉米自交系的遗传变异,初步对杂种优势类群进行划分;刘世建等[7]对四川地方玉米种质资源进行SSR聚类分析,研究了28个玉米自交系的遗传变异。乔志军等[8]对180份玉米自交系亲缘关系进行了分子评价。传统育种多由表现型间接对基因型进行选择和分类,存在很大的随机性和盲目性。分子标记技术的发展为评价玉米种质资源基础及杂种优势利用提供了新技术和手段,同时也为构建玉米品种指纹数据库提供了良好的基础。本研究选定2013年、2014年和2015年上海审定和生产应用的主要鲜食玉米品种,基于标准化的建库程序和毛细管电泳检测平台的运用,利用SSR标记技术进行指纹图谱采集,经过对引物初筛,最终选用了25对玉米SSR引物对32个玉米品种进行了指纹数据分析,并构建了DNA指纹图谱数据库,为当地玉米品种、真实性鉴定奠定了快速检测的基础,为政府的品种管理、企业的品种维权、农民的利益维护提供强有力的技术支撑,有利于保护新品种知识产权和生产者利益,促进鲜食玉米研究及种子市场的健康发展。