三黄泻心汤体外抑制耐药金黄色葡萄球菌活性测定

王钰雄，刘伟伟，李雪萍，何熙果，王艳秋

（1.成都中医药大学2013级本科生，四川 成都 611137；2.成都中医药大学基础医学院，四川 成都611137；3.成都中医药大学2015级本科生，四川 成都 611137）

“三黄泻心汤”亦称“泻心汤”，是张仲景的经典方剂，由黄连、大黄、黄芩组成，有泻火解毒、清热燥湿、除痞止血之功效，是中医临床治疗心胃火邪内炽证的常用方剂。本研究对三黄泻心汤的传统汤剂进行标准耐药金黄色葡萄球菌和普通耐药金黄色葡萄球菌的抑菌作用进行观察，探讨三黄泻心汤的抑菌作用。

1 实验仪器与药物

实验仪器：恒温培养箱，净化工作台，DHG--9125A电热恒温鼓风干燥箱，压力蒸汽灭菌器，电子天平等。

药物：大黄、黄连、黄芩（成都新荷花药业有限公司），营养琼脂培养基（成都中医药大学基础医学院实验室提供），普通耐药金黄色葡萄球菌（成都中医药大学基础医学院实验室提供），标准耐药金黄色葡萄球菌（中科院生物研究所提供）。

2 方法与结果

2.1 三黄泻心汤的制备

取中药饮片大黄10g，黄连5g，黄芩5g（质量比为2∶1∶1）混合，加300mL纯化水浸泡30 min，煎煮60 min，后浓缩为200mL，制成含生药1g/mL药液，即每1mL浓缩液相当于原生药1g，过滤后放入烧杯内密封，置4℃保存备用。实验时，稀释至相应浓度。

2.2 0.5麦氏药敏菌液的制备

0.5麦氏比浊管：0.2mL0.25%BaCl2、9.8mL1%H2SO4，约1×108/mL。1麦氏比浊管：0.4mL0.25%BaCl2、9.6mL1%H2SO4，约3×108/mL。

普通耐药菌菌液。将纯化的普通耐药菌接种于普通琼脂平板上，做好标记，35℃培养24 h，无菌操作挑取新鲜培养的菌落，加入3mL的无菌生理盐水试管中，混匀后与0.5麦氏和1麦氏标准管比较，逐步调整菌液浓度至0.5麦氏左右，作为供试菌液。

标准耐药菌菌液。按说明书方法，在超净台复苏细菌。用接种环蘸取菌液，直接涂布到琼脂平板上，做好标记35℃培养24h。按上述方法制作0.5麦氏标准耐药菌，作为供试菌液。

2.3 最低抑菌浓度（MIC）测定及结果

二倍试管稀释法。取无菌试管10只，编号A1-A10，于A2-A10中加入10mL无菌水，取中药原液20mL，于A1中加入10mL。A2中加入10mL，混合后取出10mL，加入到A3中，以此类推至A9，混合后取出10mL，弃之。A10中只有无菌水。这样就形成了从A1-A9浓度依次为10%（1∶10）、5%（1∶20）、2.5%（1∶40）、1.25%（1∶80）、0.625%（1∶160）、0.3125%（1∶320）、0.15625%（1∶640）、0.078125%（1∶1280）、0.0390625%（1∶2560）。

制备含药琼脂培养基。琼脂培养基配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂20g，溶解于1000mL纯水中，pH＝7.3±0.1。

取上述540mL培养基，分装于10个烧瓶，每个54mL，编号B1-B10，取上述稀释中药液，按6mLA1加入B1，6mLA2加入B2，以此类推，逐次将药液与培养基混匀，混合后于121℃高压灭菌15min，冷至50℃时，将B1中培养基在超净台上分别倾注6个平皿，每个10mL含药培养基，重新编号。浓度由高到低依次为A1、A2、A3、A4、A5、A6……J1、J2、J3、J4、J5、J6共60个培养皿。放4℃备用。这样每个培养基的含药浓度为对应2.3.1中药液浓度的1/10。另制备若干普通琼脂培养基备用［1］。

接种。在超净台内，用接种环蘸取上述0.5麦氏普通耐药菌菌液，在管壁挤压去多余的菌液，均匀地涂布在A-J组的平板上，另用烧灼灭菌的接种环在未编号的空白琼脂培养基上，以接种的操作划线。将上述61个平板置于35℃温箱，培养24h。24h后观察并记录各平板结果，以无菌生长的含药平板的药浓度为普通耐药菌MIC。同样的操作，确定标准耐药菌MIC。

结果显示，三黄泻心汤对标准耐药金黄色葡萄球菌、普通耐药金黄色葡萄球菌的MIC分别为2.5mg/mL、0.3125mg/mL，空白培养基未见细菌生长。结果见表1-2。

表1 不同浓度三黄泻心汤对普通耐药金黄色葡萄球菌抑菌作用测定结果 （mg/mL）

表2 不同浓度三黄泻心汤对标准耐药金黄色葡萄球菌抑菌作用测定结果 （mg/mL）

3 讨 论

三黄泻心汤中大黄、黄连和黄芩三味中药，其各成分均有一定抗菌作用［2］。本实验结果提示三黄泻心汤具有抑制MRSA的作用，对临床分离的普通耐药性金黄色葡萄球菌的抑制作用强于标准MRSA。

现代研究证实，MRSA细菌耐药的原因与β-内酰胺酶的产生和青霉素结合蛋白2a（PBP2a）的产生有关，PBP2a是一种β-内酰胺类抗生素低亲和性蛋白，在MRSA细菌耐药中起着主要的作用［3］。FtsZ蛋白是最早出现的细菌分裂蛋白，在细胞分裂中起主要作用，介导PBP2在细胞分裂过程中插入到细胞膜中，由于PBP2是MRSA抗β内酰胺类抗菌素所需要的，因此破坏其活性可重新使MRSA对β内酰胺类变得敏感。抑制FtsZ蛋白还能抑制MRSA的生长和生存能力。因此我们推测FtsZ蛋白有可能是三黄泻心汤治疗MRSA的作用靶点之一。

本研究表明，三黄泻心汤对普通耐药菌和标准耐药菌均有较强的抑制作用，对前者的活性是后者的8倍，由此证明三黄泻心汤对耐药菌有较强的抑制作用，但三黄泻心汤对于FtsZ的作用影响有待进一步研究。