高密度菌种发酵酸奶品质变化研究

孙文伶，赵丽娜，董 阳，刘 畅，马 玲*

（山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 晋中 030801）

近年来，酸奶已成为人们生活中一种常见的乳制品，受到了消费者的青睐并且需求量不断增长[1]。除了与其良好的风味、口感和丰富的营养价值有关之外，还与其中含有的乳酸菌可以调节人体生理功能有关。酸奶中的乳酸菌（Lactobacillus）是健康人肠道正常菌群，可在人体肠道中生长、繁殖，调整肠道菌群平衡，抑制并清除肠道中对人具有潜在危害的细菌。因此提高酸乳中乳酸菌的密度成为研究热点，成为传统食品发展方向[2]。

高密度培养技术（high cell density culture，HCDC），是指应用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有10倍以上显著提高[3]，可以缩短生产时间、减少设备投资，降低生产成本，从而极大地提高产品市场竞争力[4]。筛选优良菌株是制备酸奶发酵剂的基础[5]。因乳酸菌在产品发酵及冷藏过程中易受到损害，导致数量大大减少，高密度培养乳酸菌对工业生产及产品研发具有现实意义[6]。有研究表明[7-8]，影响乳酸菌高密度培养的因素主要有以下几个方面：培养基成分、培养条件、培养模式及培养过程中抑制性代谢产物的调控等。国内外已有乳酸菌基础培养基的优化或改良、增殖培养基的优化或改良、添加各种促生长的提取物、添加维生素、盐或植物蛋白作为增殖因子等手段来调配培养基成分或性质使其菌体达到高密度的目的。吴祖芳等[9]通过添加番茄汁培养菌株LactobacillusH17，得出其明显有促进菌体生长的作用，胡萝卜提供维生素，牛奶是乳酸菌生长的天然基质。国外在乳酸菌高密度培养技术上已经很成熟并应用在生产中，而国内在这方面还没有较成熟的体系，有基础研究的报道但很少得到应用。

本试验对普通酸奶发酵剂的培养方法进行改良，在乳酸菌发酵后期加入适当比例及含量的营养物质（胡萝卜汁、番茄汁、乳清等）以及牛乳改变培养基组分以获得高密度发酵菌种。对高密度菌种与非高密度菌种发酵所得酸奶的菌落总数、保水性、黏度、pH、滴定酸度、稳定性、风味的检测结果进行对比分析，并进行感官评价，为发展高密度菌种制作酸奶奠定基础，同时也为今后工业化生产不同类型的产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料与菌株

混合乳酸菌种（保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus））：山西农业大学食品科学与工程学院。

鲜牛乳（新鲜、无抗）：山西农业大学动物科技学院；番茄、胡萝卜：市售；乳清：自制奶酪后所得。

1.1.2 化学试剂

Na2CO3（分析纯）：萧县化学试剂厂；磷酸氢二钾、葡萄糖（均为分析纯）：天津市北辰方正试剂厂；乙酸钠、吐温80、MgSO4、MnSO4（均为分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司；β-磷酸甘油二钠（分析纯）：北京Solarbio科技有限公司。

1.1.3 培养基

MRS培养基：蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母提取物5 g、磷酸氢二钾2 g、乙酸钠5 g、葡萄糖20 g、吐温-80 1 mL、MgSO40.58 g、MnSO40.25 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL。121℃灭菌15 min。

M17培养基：酪蛋白的胰蛋白酶消化物2.5 g、肉的胃蛋白酶消化物2.5 g、大豆的木瓜酶消化物5.0 g、酵母提取物2.5 g、β-磷酸甘油二钠10 g、牛肉膏5 g、硫酸镁0.25 g、抗坏血酸0.5 g、蒸馏水950 mL。121℃灭菌15 min。

1.2 仪器与设备

NDJ-1指针式黏度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；HPP-9272恒温培养箱：北京东联哈尔仪器制造有限公司；LD5-2B低速离心机：北京雷勃尔医疗器械有限公司；7200型可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；FE28-Standard pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Trace 1300-ISO气质联用仪：美国Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 酸奶加工工艺流程

（1）高密度乳酸菌发酵剂的制备

鲜牛奶（新鲜，无抗）→灭菌（121℃、30 min）→冷却（40℃）→接种（3%，V/V）→搅拌→灌装→发酵（42℃，2.5 h）→调节pH（当牛奶的pH降低至4.6时，加入滤膜除菌的15%碳酸钠使其pH达到6.6）→添加营养物质（番茄汁∶胡萝卜汁∶乳清∶鲜牛奶=1∶1∶1∶1）→发酵（4 h，乳酸菌数达到109CFU/mL）

（2）高密度乳酸菌酸奶的制备

鲜牛奶（新鲜，无抗）→加糖→杀菌（95℃、5～10 min）→冷却（40℃）→接种高密度乳酸菌发酵剂（3%，V/V）→搅拌→灌装→发酵（42℃，4～5 h）→冷藏→后熟→成品

1.3.2 分析检测

采用吴祖芳等[9]研究方法测定细菌总数；使用黏度计及pH计测定酸奶的黏度及pH值；采用陈岑等[10]研究的酸碱滴定法测定酸奶酸度。

（1）稳定性的测定[11]

将静置24 h后的酸奶样品稀释80倍，在波长540 nm处测定样品的吸光度值A1；然后取酸奶50 mL，4 000 r/min离心10min，取上层乳液在波长540nm处测吸光度值A2。酸奶稳定性R（R值越大悬浮稳定性越好）计算公式如下：

（2）保水性的测定[12-13]

取一定量酸奶于离心管中，称量离心管的质量m1和酸奶与离心管的质量m2，以3 500 r/min离心10 min，除去上清液，称量离心后的酸奶和离心管质量m3。酸奶稳定性S计算公式如下：

（3）挥发性风味物质的测定[14]

样品前处理：固相微萃取（solid-phasemicro-extraction，SPME）萃取酸奶中的挥发性风味物质，萃取50 min，250℃解吸附3 min。

气相色谱条件：HP5973色谱柱（30m×0.25mm，0.25μm）。采用程序升温方式，初始温度35℃，保持3min；再以4℃/min升至140℃，保持1 min；再以10℃/min升至250℃；再保持3min；进样口温度为250℃；载气为氦气（He），流速1.0mL/min；不分流进样。

质谱条件：电离方式为电子电离（electronic ionization，E1）源，电子能量70 eV；发射电流100 μA；离子源温度为230℃；质谱扫描范围33～450 amu。

定性定量方法：参考相关文献资料及标准库进行检索，定性化合物，按照每一组分峰面积占总峰面积的百分比定量。

（4）酸奶的感官评价

评定小组由10位有食品评价经验的人员组成，对酸奶的外观、气味、口感、组织状态、酸甜度进行评价；各项满分各为20分，各项评分值的和为感官评价总分，满分100分，酸奶感官评价标准见表1。

表1 酸奶样品感官评分标准Table 1 Sensory evaluation standards of yogurt samples

2 结果与分析

2.1 菌落总数的对比

酸奶中最重要的成分为乳酸菌，其数量直接影响酸奶的品质以及酸奶对人体的生理功能。将高密度与非高密度酸奶分别取样，在培养温度为42℃的MRS培养基与M17培养基上培养，每隔3 d取酸奶样培养记录一次，所得16 d内两种酸奶中菌落总数随时间的变化如图1所示。

图1 两种酸奶菌落总数随放置时间的变化Fig.1 Changes of total numbers of colony in two kinds of yogurts during storage

由图1可知，随着放置时间（0～16 d）的延长，高密度与非高密度酸奶的菌落总数对数值均不断下降（从8.71和8.53下降至8.23和8.03），但高密度酸奶的菌落总数高于非高密度酸奶的菌落总数。这可能是由于在高密度酸奶的菌种的培养后期加入了碳酸钠，使得由于不断产生的乳酸降低的培养液pH值得到回升。因pH值＜4时会严重抑制菌体的生长[15]，因此加入碳酸钠起到了一定的缓冲作用，使得培养环境更适合菌体生长。此外，在培养的后期加入的营养物质，使培养基成分得以补充，菌体生长可利用的营养成分增加，有利于菌体的生长，从而使高密度菌种中单位体积包含更多的乳酸菌细胞数，相应的由高密度菌种制作的酸奶中乳酸菌的数量也较非高密度酸奶高。

2.2 滴定酸度和pH值的对比

滴定酸度和pH值是酸奶的重要指标，与酸奶品质有很大的关系。高密度与非高密度酸奶的pH值及酸度随时间的变化趋势结果如图2所示。

图2 两种酸奶pH值（A）和滴定酸度（B）在贮藏过程中的变化Fig.2 Changes of pH value(A)and titration acidity(B)of two kinds of yogurts during storage

由图2可知，两种酸奶的pH值均随着放置时间的延长而逐渐降低。1～4 d的时候下降比较缓慢，4～7 d时迅速下降，之后下降趋于平缓，在这期间高密度酸奶的pH值一直稍低于非高密度酸奶。而滴定酸度的变化趋势正好与pH值相反，但变化规律一致。可能是因为酸奶在储存过程中保加利亚乳杆菌继续发酵乳糖，导致后酸化，导致pH值逐渐降低[16]。各个发酵剂的产酸能力不同导致酸奶pH值和酸度的变化差异[17-18]。而到后期随着酸度增加抑制了菌的活性，产酸速度下降，从而pH值和滴定酸度的变化趋于平缓。由于高密度酸奶中菌落总数较非高密度酸奶中多，因此在后期放置过程中高密度酸奶的滴定酸度总是高于非高密度酸奶。

2.3 黏度、稳定性及保水性的对比

黏度、稳定性和保水性是酸奶重要的物理学特性，反映了酸奶的品质。高密度与非高密度酸奶的黏度、稳定性及保水性随时间的变化如图3所示。

图3 两种酸奶黏度（A）、稳定性（B）及保水性（C）在贮藏过程中的变化Fig.3 Change of viscosity(A),stability(B)and water retention(C)of two kinds of yogurts during storage

由图3可知，在试验期间，两种酸奶的黏度一直在下降。储藏7 d黏度下降速度较快，之后下降速度趋于平缓。且在整个期间高密度酸奶的黏度一直稍低于非高密度酸奶。保水性和稳定性的变化趋势和黏度的一致。可能是因为发酵剂菌种产生的蛋白酶在发酵结束以后继续作用并催化底物蛋白，同时酸奶在储存期间酸度逐渐降低，达到酪蛋白的等电点时，酪蛋白胶粒进一步进行聚集沉降[19-20]，这两方面会引起酸乳中微小蛋白质亚胶体分子团改变，使得他们之间的亲合连接作用减弱，进而引起酸乳胶体的刚性降低和胶体分子团聚集成的蛋白质网络松散，导致酸奶的稳定性下降，结果使酸乳的黏度降低、保水性下降[21-22]。高密度酸奶的稳定性（0.06～0.29）、黏度（1.53～4.23）和保水性（0.455～0.813）均与非高密度酸奶稳定性（0.20～0.35）、黏度（1.73～4.38）和保水性（0.407～0.575）相差不大（P＞0.05）。

2.4 挥发性风味物质的对比

采用GC-MS法对高密度和非高密度酸奶中挥发性风味物质进行测定，高密度与非高密度酸奶样品中各类挥发性成分种类及所占的相对含量分析如图4所示。

图4 两种酸奶中挥发性风味物质种类（A）及相对含量（B）Fig.4 Kinds(A)and relative contents(B)of volatile flavor components in two kinds of yogurts

由图4可知，高密度与非高密度酸奶中有很多种风味物质，其风味特征是酮、酸、酯、醛、醇等综合作用的结果[23]。高密度酸奶中共检测到24种化合物，非高密度酸奶中共检测到20种化合物，都是乳酸菌在发酵过程中产生的。两种酸奶中高密度酸奶所含酸类物质种类多，除了乙酸、己酸外还有辛酸，且相对含量较非高密度的高。酮类物质中，高密度酸奶的3-羟基-2-丁酮含量较高，酸奶产生的奶味浓醇。相比较而言，高密度酸奶的酯和酮等挥发性风味物质相对含量较高，其中酯类物质的相对含量为0.52%远高于非高密度酸奶的0.41%，而酮类物质的相对含量为0.048%高于非高密度酸奶的0.012%，这些风味物质使得酸奶的风味更加诱人，风味物质对酸奶的风味协调性和风味强度均有不同程度的影响作用[24-25]。

2.5 感官评价

由图5可知，相比较而言高密度酸奶具有较好的感官特性。高密度酸奶的色泽均匀一致、有浓郁的风味、口感细腻酸甜可口且状态稳定，几乎无乳清析出，黏度适宜。因此，各项指标的综合评分较高。非高密度酸奶的口感和组织状态与高密度的相差不大，在酸甜度等方面可能因为高密度酸奶产酸较多，因此更可口。在储藏期内，高密度酸奶的感官评分始终高于非高密度酸奶。其中对风味贡献较大的醛类、酯类、酮类物质的含量均高于非高密度酸奶，可能因为高密度酸奶中的乳酸菌数量较高，其储藏过程中代谢形成了更多的酶，这些酶催化反应形成了更多的风味物质。

图5 两种酸奶感官评分在贮藏过程中的变化Fig.5 Changes of sensory evaluation of two kinds of yogurts during storage process

3 结论

应用化学中和法结合补加营养物质的方法制作高密度乳酸菌发酵剂，并对高密度乳酸菌发酵剂和非高密度乳酸菌发酵制作的酸奶在放置过程中的菌落数、酸度、保水性、稳定性、黏度、感官评价以及风味物质进行比较，结果表明，高密度菌种发酵制备的酸奶菌落总数对数值、滴定酸度及感官评分均高于非高密度菌种发酵制备的酸奶，而二者pH值、黏度、稳定性、保水性相差不大。高密度与非高密度菌种发酵酸奶中共检测风味化合物分别为24、20种，其中酯类物质的相对含量分别为0.52%、0.41%，酮类物质的相对含量分别为0.048%、0.012%。综上，高密度酸奶各方面均优于非高密度酸奶，为今后研究高密度酸奶提供了依据，可以在进一步完善相关工艺的基础上开发系列高密度酸奶产品。