拮抗菌巨大芽孢杆菌L2发酵条件的响应面优化

吉玉玉，黄 慧，肖 洋，陈 雪，代园凤，李 祝*，杨 龙，张 素，赵妗颐，唐婧红，张钦语

（1.贵州省烟草公司 毕节市公司，贵州 毕节 551700；2.贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州省产品质量监督检测院，贵州 贵阳 550016）

果蔬采后病原真菌的侵染是引起果实腐烂的重要原因之一[1-2]。据统计，由微生物侵染造成的采后果蔬腐烂占20%～25%[3]。链格孢菌（Alternaria alternata）属于半知菌亚门链格孢属，是番茄、甜瓜、梨、苹果等众多果蔬采后病害的主要病原菌[4-5]，会造成贮藏、运输和销售中的大量烂果，损失严重。目前，使用化学杀菌剂仍是现在世界各国控制采后果实病害的主要方法[6]。但是长期使用化学药剂会导致病原菌产生抗药性，还会因果蔬农药残留量增加而威胁着人类的身体健康[7]。因此，发展无公害型生物农药来控制果蔬采后病害成为一种新趋势，逐渐成为研究热点[8-10]。在过去的20多年里，生物防治作为一种防治采后果实腐烂的有效方法而涌现出来[11-17]，此方法具有贮运条件易控制、处理目标明确、外界微生物干扰少、产品集中、处理费用低廉等特点和优点[18]。目前，应用较多的生防细菌主要有芽孢杆菌（Bacillusspp.）、土壤放射杆菌（Agrobacterium radiobacter）、假单胞杆菌（Pseudomonasspp.）等[19]。

芽孢杆菌属菌是生物防治中常用的拮抗菌[20]，具有繁殖快速、生命力强、安全无毒等特点。ABDALLA S A等[21]测试了45株芽孢杆菌菌株抑制番茄早疫病菌的能力，发现其中28株有抑制链格孢菌生长的能力（表现出明显的抑菌圈）。ARREBOLA E等[22]从水果表面分离出解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PPCB004，发现其对7种不同柑橘采后的真菌病原体具有抗菌活性。巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）L2作为一种植物根系促生细菌[23]，是一种抑菌谱较广的生防菌株[24]，针对不同植物的真菌和细菌病害均具有防治作用（如毛竹枯梢病[25]、烟草灰霉病[26]、香蕉灰斑病[26]、甘薯黑斑病[26]等），其中对真菌病原菌的抑制能力强于对细菌病原菌的抑制[27]。根据课题组前期初步研究，发现菌株L2可有效抑制链格孢菌的生长[28]。继而以抑菌圈直径评价菌株L2抗菌物质对链格孢菌的抑制活性，采用响应面法快速优化产抗菌物质的发酵条件，从而获得最佳的发酵工艺来提高菌株L2的抑菌活性，有效预防由微生物侵染造成的采后果蔬腐烂现象，为研究开发新型果蔬生物防腐剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）L2：由贵州大学真菌资源研究所分离，现保藏于中国典型培养物保藏中心（China center for type culture collection，CCTCC）（武汉大学），保藏号：CCTCC NO.M2012381。

链格孢菌（Alternaria alternata）：由贵州大学生命科学学院真菌资源研究室分离、筛选、鉴定并保存。

1.1.2 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂（potatodextroseagar，PDA）培养基：马铃薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L、蒸馏水1 L、pH自然。

NB培养基：蛋白胨10 g/L，葡萄糖5 g/L，氯化钠5 g/L，牛肉膏3 g/L，蒸馏水1 L，pH 7.0～7.2（NA培养基：NB培养基中加入琼脂15～20 g/L）。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1FD单人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；FA2204N电子天平：上海菁海仪器有限公司；SHP-250智能生化培养箱：上海光都仪器设备有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；SHZ-83A离心机：荣华股份有限公司；PHS-3C精密酸度计：上海大普仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种的活化与培养

将保存的巨大芽孢杆菌L2接种于NA斜面培养基上，30℃培养活化，再用接种环刮取两环接种至NB培养液中，30℃、150 r/min培养20 h作为种子菌液。

1.3.2 发酵滤液的制备

在250mL三角瓶中装入NB培养液后灭菌，无菌条件下向三角瓶内接入种子菌液，30℃、150 r/min培养48 h。将发酵液经5 500 r/min离心25 min，取上清液，经孔径0.22 μm的细菌过滤器过滤，除去菌体，制得无菌发酵滤液备用。

1.3.3 抑菌活性的测定

以链格孢菌为指示菌，采用牛津杯法[29]对发酵液抑菌活性进行测定，活性大小以抑菌圈直径（mm）表示。以未接种孢子悬液培养的PDA培养基作为空白对照，将牛津杯置于指示平板中央，取250 μL制备好的菌株L2无菌滤液于牛津杯中，28℃培养48h，用十字交叉法测量抑菌圈直径，取平均值。以上步骤均按无菌要求进行操作，每个处理设3个重复。

1.3.4 巨大芽孢杆菌L2发酵条件优化

（1）单因素试验

碳源：以葡萄糖、乳糖、麦芽糖、淀粉、蔗糖和山梨糖作为碳源，添加量为5 g/L，其他成分同初始培养基，配制发酵培养基。确定最佳碳源后对其进行质量浓度优化，选取质量浓度梯度为5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L。

氮源：以硝酸铵、尿素、硫酸铵、酵母膏、精氨酸、谷氨酸、牛肉膏作为氮源，添加量为5 g/L，其他成分同初始培养基，配制发酵培养基。确定最佳氮源后对其进行质量浓度优化，选取质量浓度梯度为2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L、3.5 g/L、4.0g/L、4.5g/L、5.0 g/L、5.5 g/L、6.0 g/L。

无机盐：以不加无机盐的培养基为空白，在此基础上分别加入5g/L硫酸锰、硫酸镁、氯化钠、三氯化铁、磷酸氢二钾和碳酸钙，其他成分同初始培养基，配制培养基。确定最佳无机盐后对其进行质量浓度优化，选取质量浓度梯度为2.0g/L、2.5g/L、3.0g/L、3.5g/L、4.0g/L、4.5g/L、5.0g/L、5.5g/L、6.0 g/L。

设置菌株L2在三角瓶的接种量依次为2%、4%、6%、8%、10%、12%；pH值梯度为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；装液量依次设为25 mL/250 mL、50 mL/250 mL、75 mL/250 mL、100 mL/250 mL、125 mL/250 mL；将各种影响因素在NB发酵培养基的条件上逐一改变，确定每个因素的最佳范围。

（2）响应面法优化培养条件

在单因素、PB试验和最陡爬坡试验的基础上，以抑菌圈直径作为响应目标，利用响应面方法中的Box-Behnken Design（BBD）方法设计试验，通过试验数据拟合得到二阶响应面模型，最终确定最优试验条件。用Minitab软件对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素优化

2.1.1 碳源种类及添加量的优化

图1 碳源对抑菌圈直径的影响Fig.1 Effect of carbon sources on inhibitory zone diameter

不同碳源对菌株L2的抑菌效果见图1。由图1可知，巨大芽孢杆菌L2对葡萄糖、蔗糖、麦芽糖都能很好的利用。葡萄糖作为唯一碳源时，抑菌圈直径达到（14.55±0.43）mm，比其他糖的效果都好，故选择葡萄糖作为菌株L2液体培养基的碳源。不同质量浓度葡萄糖的抑菌效果见图2。

图2 葡萄糖添加量对抑菌圈直径的影响Fig.2 Effect of glucose addition on inhibitory zone diameter

由图2可知，当葡萄糖添加量为15 g/L时，抑菌圈直径最大，为（17.44±0.35）mm，故选择15 g/L葡萄糖作为最优碳源添加量。

2.1.2 氮源种类及添加量的优化

图3 氮源对抑菌圈直径的影响Fig.3 Effect of nitrogen sources on inhibitory zone diameter

图4 牛肉膏添加量对抑菌圈直径的影响Fig.4 Effect of beef extract addition on inhibitory zone diameter

不同氮源对菌株L2的抑菌效果见图3。由图3可知，牛肉膏作为氮源时，抑菌圈直径最大，达到（18.05±0.26）mm；其次是精氨酸、硫酸铵和硝酸铵，尿素和谷氨酸作为氮源时，抑菌圈直径较小，故选用牛肉膏作为最适氮源。不同质量浓度牛肉膏的抑菌效果见图4。由图4可知，当牛肉膏添加量为4.5g/L时，抑菌圈直径达到（24.59±0.32）mm，故选择4.5g/L牛肉膏作为最优氮源添加量。

2.1.3 无机盐种类及添加量的优化

不同无机盐对巨大芽孢杆菌L2的抑菌效果见图5。由图5可知，巨大芽孢杆菌L2对镁离子、锰离子、钙离子、磷酸氢二钾都能较好的利用，而铁离子则抑制巨大芽孢杆菌的生长[30]，从而影响了其抑菌效果。氯化钠对L2的抑菌效果最明显，抑菌圈直径达到（28.48±0.31）mm，故选择氯化钠作为发酵培养基的最适无机盐。不同质量浓度氯化钠的抑菌效果见图6。由图6可知，氯化钠添加量为3.0g/L时优于其他质量浓度，抑菌圈直径达到最大，为（29.71±0.27）mm。

图5 不同无机盐对抑菌圈直径的影响Fig.5 Effects of different inorganic salts on inhibitory zone diameter

图6 氯化钠添加量对抑菌圈直径的影响Fig.6 Effect of sodium chloride addition on inhibitory zone diameter

2.1.4 接种量的优化

接种量对菌体生长有影响，所以接种量要适度，不同接种量对抑菌效果的影响如图7所示。由图7可知，当接种量为6%时，抑菌圈直径达到最大，为（24.22±0.50）mm，故选择最佳接种量为6%。

图7 接种量对抑菌圈直径的影响Fig.7 Effect of inoculum on inhibitory zone diameter

2.1.5 初始pH值的优化

培养基中pH值会影响细胞代谢酶活性和营养物质的离子化程度，进而影响微生物生长代谢[31]，初始pH值对抑菌效果的影响如图8所示。由图8可知，当发酵初始pH值为7.0时抑菌圈直径达到最大，为（27.33±0.26）mm，故选择发酵pH=7.0为响应面试验中心试验点。

图8 初始pH值对抑菌圈直径的影响Fig.8 Effect of initial pH value on inhibitory zone diameter

2.1.6 装液量的优化

图9 装液量对抑菌圈直径的影响Fig.9 Effect of loading volume on inhibitory zone diameter

巨大芽孢杆菌是好氧细菌，低的装液量使得液体培养基中溶解氧升高，满足菌体生长和代谢的要求，使得产抗菌物质活性提高，不同装液量对抑菌圈直径的影响见图9。由图9可知，装液量为50 mL/250 mL时，发酵液对病原菌抑菌圈直径为（27.53±0.26）mm，比装液量为25 mL/250 mL、75mL/250mL、100 mL/250 mL的效果好，故选择装液量为50 mL/250 mL。

2.2 响应面法优化培养条件

2.2.1 响应面试验设计

通过前期PB试验、最陡爬坡试验确定主效应因素为牛肉膏、氯化钠和初始pH值，并以牛肉膏4.58 g/L，氯化钠3.23 g/L、初始pH值7.0为中心点进行设计。利用Minitab软件的Box-Behnken设计原理，对巨大芽孢杆菌L2培养条件进行3因素3水平试验，选择牛肉膏（X1）、氯化钠（X2）、初始pH值（X3）3个因素为自变量，以抑菌圈直径（Y）为响应值，试验设计及结果如表1所示。

表1 巨大芽孢杆菌L2发酵条件优化响应面试验结果与分析Table 1 Results and analysis of response surface experiments for fermentation conditions optimization ofBacillus megaterium L2

2.2.2 二次回归模型的建立及检验

根据Minitab软件得到拟合二阶模型公式：Y=34.9533+0.3162X1+0.0812X2+0.0625X3-0.3767X12-0.2567X22-0.4242X32-0.025 0X1X2-0.032 5X1X3+0.012 5X2X3

回归方程方差显著性检验分析见表2，回归方程模型P=0.000＜0.01，说明方程拟合度较好；失拟项P=0.122＞0.05，说明失拟不显著，模型不失拟，选择合理。根据表2中F（X1）=261.62，F（X2）=17.27，F（X3）=10.22，说明各因素条件对抑菌圈直径的影响程度存在差异，各因素影响的主次顺序为X1＞X2＞X3，即牛肉膏＞氯化钠＞初始pH值。X1（牛肉膏）、X2（氯化钠）、X3（初始pH值）对抑菌圈直径的线性效应显著，各因素之间交互作用对抑菌圈的交互影响不显著（P＞0.05），X12（牛肉膏的二次项）、X22（氯化钠的二次项）、X32（初始pH值的二次项）对抑菌圈的影响极显著（P＜0.01）。复相关系数R2=99.29%，说明实验值和预测值之间有较强的相关性，校正决定系数R2adj=98.02%，表明模型拟合较好。

表2 回归方程的方差分析Table 2 Variance analysis of the regression equation

2.2.3 响应曲面的拟合及最优条件的确定

固定其中的一个因素，利用Minitab软件做另外两个因素交互作用的曲面图及等值线图，确定牛肉膏、氯化钠及初始pH值对抑菌圈直径的影响。结果见图10。

由图10可知，牛肉膏、氯化钠、初始pH值相互作用对菌株L2抑菌活性的影响均出现抛物面型关系，所得到的响应面都存在一个极大值点，其中牛肉膏与初始pH值之间的交互作用最为明显。

经过响应面优化，根据拟合二阶模型公式得到理论上的培养基配方为牛肉膏添加量4.58 g/L，氯化钠添加量3.23 g/L，初始pH值为7.0时，抑菌圈直径最大为34.77 mm。为了验证所得到的最佳培养基组成是否可靠，同时考虑了实际操作的可行性，将培养基成分调整为牛肉膏添加量4.6 g/L、氯化钠添加量3.0 g/L，初始pH值为7.0，进行3次重复试验，得到L2抑菌圈直径为（34.99±0.14）mm，与预测值34.77 mm拟合度高，说明该模型能很好得模拟和预测实验结果，证实了模型的有效性。

图10 牛肉膏、氯化钠和初始pH值交互作用对抑菌圈大小影响的响应曲面和等高线Fig.10 Response surface plots and contour lines of effects of interactions between beef extract,NaCl and initial pH value on inhibitory zone diameter

3 结论

本试验以病原真菌链格孢菌为指示菌，在单因素的基础上，利用响应面法对巨大芽孢杆菌L2抗菌性能的发酵条件进行了研究，结果得到最优发酵条件：葡萄糖添加量15 g/L，牛肉膏添加量4.6 g/L，氯化钠添加量3.0 g/L，初始pH为7.0，装液量50 mL/250 mL，接种量6%，优化后发酵液抑菌圈直径为（34.99±0.14）mm，比原始发酵条件下的抑菌圈直径为（14.55±0.43）mm提高了140.48%。试验筛选出牛肉膏、氯化钠和初始pH值为主效应因素，说明培养基成分与酸碱性对菌株L2产生抑菌物质的影响较显著，为后续进一步优化发酵条件和投入生产提供依据。但本研究是在实验室摇瓶条件下进行，要实现工业化大规模开发生产，还需进一步培养工艺的研究。