青钱柳和桑叶配伍组方的降血糖作用

盛雪萍，赵梦鸽，蒋翠花，张 健，殷志琦

(1中国药科大学中药学院中药制剂系&天然药物活性组分与药效国家重点实验室，南京 210009；2江苏省中医药研究院转化医学实验室，南京 210028)

糖尿病是一种多病因的代谢类疾病，可引发多种并发症，如糖尿病肾病、糖尿病足、糖尿病酮症酸中毒等[1]。据世界卫生组织(WHO)报道，2014年全球有4.22亿人患有糖尿病，18岁以上成人糖尿病患病率从1980年的4.7%增加到2014年的8.5%[2]。目前糖尿病治疗的首选方案是在生活方式干预基础上，给予二甲双胍、磺脲类、DPP-4抑制剂、SGLT2抑制剂等药物[3]，但许多糖尿病患者接受治疗后血糖控制不理想[4]。现有的糖尿病治疗药物作用机制或靶点相对单一，易产生耐药性，部分药物(如磺脲类)存在一定心血管损伤，限制了其使用[5-6]。天然药物治疗糖尿病具有低毒、多成分、多靶点的整体协同作用优势，利用天然药物设计新的降糖药物或组方药物能改善糖尿病患者多种临床症状，达到降糖或辅助降糖的功效[7-9]。

青钱柳[Cyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinsk]为胡桃科青钱柳属植物，传统作为茶叶饮用，被誉为降糖神茶，于2013年被列入新资源食品目录[10]。现代药理研究证实青钱柳可改善胰岛素抵抗，显著降低血糖[11-12]。桑叶是桑科植物桑(MorusalbaL.)的干燥叶，始载于《神农本草经》，为药食两用食材，桑叶可抑制血糖上升，促进胰岛素分泌，保护胰岛细胞，发挥降血糖功效[13-15]。已有文献证实，在糖尿病发生发展中往往同时具有胰岛素抵抗和胰岛受损而胰岛素分泌不足的特征[16]。因此将青钱柳和桑叶配伍组方，既能改善胰岛素抵抗，又能促进胰岛素分泌，发挥协同作用降低血糖。本研究通过诱导2型糖尿病大鼠模型，检测血糖、血脂、胰岛素、糖耐量以及肝肾指标，评价青钱柳和桑叶组方药物的降血糖效果和安全性。

1 材 料

1.1 药品与试剂

四氧嘧啶[ALX,阿拉丁试剂(上海)有限公司]；葡萄糖粉剂(江西红星药业有限公司)；盐酸二甲双胍肠溶片(北京利龄恒泰药业有限公司)；胰岛素试剂盒购自(南京建成生物工程研究所)；血糖试纸(拜耳医药保健有限公司)。

1.2 仪 器

酶联免疫检测仪(美国Bio Tek公司)；超速控温离心机(美国Beckman Coulter公司)；荧光倒置显微镜(德国Carl Zeiss公司)；全自动分析仪Cobas 8000[罗氏诊断产品(上海)有限公司]；血糖仪HGM-114(苏州尔达医疗设备有限公司生产)。

1.3 动 物

所选实验动物为成年雄性SD大鼠，体质量(200±20)g，由南通大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(苏)2014-0001，饲养环境SPF级。

1.4 动物饲料

TP0850高热能饲料(猪油10%、蔗糖15%、蛋黄粉15%、酪蛋白5%、胆固醇1.2%、胆酸钠0.2%、碳酸氢钙0.6%、石粉0.4%、鼠维持料52.6%)以及LAD0011标准饲料购自南通特洛菲科技有限公司。

1.5 药物制备

青钱柳[Cyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinsk]来源为溧阳青钱柳，桑(MorusalbaL.)来源为安徽石台桑叶。取青钱柳干燥叶1 kg，粉碎，以水15 L 70 ℃提取1 h，过滤，浓缩干燥得青钱柳水提物114 g (出膏率为11.41%)；同法制备桑叶水提物231 g (出膏率为23.14%)。所得提取物分别用蒸馏水溶解，贮存于-4 ℃冰箱备用。

2 方 法

2.1 造模及给药方式

参考国家食品药品监督管理局以国食药监保化〔2012〕107号印发《辅助降血糖功能评价方法》中方案二构建四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠模型[17]。

SD大鼠适应5 d后，称重，按体重将大鼠随机分成8组。空白组(Blank)不做处理；模型组(Model)给予同体积蒸馏水；阳性药组(Met)给予二甲双胍[150 mg/(kg·d)]；青钱柳组(CP)给予青钱柳水提物，桑叶组(ML)给予桑叶水提物；青钱柳叶和桑叶组方药物组CM1、CM2、CM3分别给予青钱枊叶和桑叶3∶1、1∶1、1∶3混合物。本实验中给药剂量均以生药量计算，待测药物组给药剂量为1 g/(kg·d)，连续给药33 d。空白组持续以标准饲料喂养，其他组标准饲料喂养1周后更换饲料，以高热能饲料喂养3周后，禁食24 h(不禁水)，腹腔注射ALX 105 mg/kg(1 mL/100 g)，注射后继续给予高热能饲料喂饲5 d。记录SD大鼠每周体重变化。

2.2 生化指标检测

给药第33天，进行口服葡萄糖耐量试验(2.5 g/kg)，分别在0、0.5、2 h测定其血糖并计算血糖曲线下面积AUC。试验结束后，隔天禁食12 h，检测计算体重、空腹血糖(FBG)、糖耐量(OGTT)、血清胰岛素(Ins)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)、血脂指标[总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)]和肝肾指标[谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、尿酸(UA)]。取胰腺组织和肝脏组织样本，做组织切片，HE染色后观察并拍照。

2.3 统计学处理

3 结 果

3.1 青桑组方对大鼠体重的影响

如表1所示，第3周开始，模型组体重比空白组高，差异有统计学意义(P<0.01)。第4周开始，CP组与模型组相比体重明显较高(P<0.05)。实验结束后，CP、CM1组相比其他组体重偏高，ML、CM2、CM3组体重较模型组呈下降趋势。

GroupWeight/g1st week2nd week3rd week 4th week5th weekBlank266.47±21.56295.29±35.87284.64±35.04279.08±34.54291.92±33.72Model262.87±25.42305.47±28.23326.20±33.13**331.71±49.62**335.21±41.98**Met264.27±22.53300.53±39.05314.13±40.80341.43±52.80321.00±36.31CP269.07±22.64316.79±17.57342.43±29.27371.64±42.28#378.00±44.81#ML257.36±25.26298.38±25.05302.93±31.73311.08±33.01323.60±39.54CM1258.60±19.24307.07±30.48324.93±46.04348.42±41.13353.18±44.05CM2262.33±24.24315.67±35.88327.60±47.09320.92±31.65311.13±38.15CM3259.20±16.75310.67±34.20327.53±46.05335.20±47.04323.56±52.05

Met:Metformin (150 mg/(kg·d));CP:Water extract ofC.paliurus,1 g/(kg·d);ML:Water extract of Mulberry leaves,1 g/(kg·d);CM1-CM3:the extract mixture ofC.paliurusand Mulberry leaves with the ratio as 3∶1,1∶1 and 1∶3

**P<0.01vsblank group;#P<0.05vsmodel group

3.2 青桑组方对大鼠FBG和血脂的影响

从FBG指标(表2)来看，模型组的FBG水平比空白组高，差异有统计学意义(P<0.05)，模型成立。与模型组相比，Met、CP、ML组的FBG分别下降20.54%、20.18%、2.18%；CM1、CM2、CM3组较模型组的FBG分别下降了21.64%、16%、12.55%，CM1组与CP组SD大鼠FBG均显著改善(P<0.05)，二者差异不明显。

从血脂指标来看，模型组与空白组相比，TC、LDL-C显著性升高(P<0.01)，TG、HDL-C无显著性差异，模型成立。ML组、CM3组的TC、LDL-C值相比模型组显著性下降(P<0.05)，其中ML组TC、LDL-C分别下降17.90%和27.48%，CM3组TC、LDL-C分别下降19.65%和20.45%；其他药物组对血脂指标无明显影响。

3.3 青桑组方对大鼠糖耐量的影响

模型组与空白组相比，0 h、0.5 h、2 h血糖以及AUC均较高，差异有统计学意义(P<0.01)，且0.5 h时模型组血糖大于10 mmol/L，判定模型成立(表3)。与模型组相比,Met、CP、CM1组0 h血糖显著性降低(P<0.05)，0.5 h时各药物组与模型组相比血糖均下降，Met、ML、CM1组差异有统计学意义(P<0.05)，除CM3组外其余药物组2 h血糖相比模型组均显著性下降(P<0.05)。Met、CP、ML、CM1组AUC与模型组相比显著下降(P<0.05)，CM2、CM3组有下降趋势。

GroupFBG/(mmol/L)TC/(mmol/L)TG/(mmol/L)HDL-C/(mmol/L)LDL-C/(mmol/L)Blank4.25±0.782.29±0.350.55±0.112.04±0.290.60±0.14Model5.50±0.86**4.58±0.51**0.67±0.121.75±0.173.13±0.46**Met4.37±0.70#4.41±0.530.71±0.182.23±0.492.77±0.69CP4.39±0.73#4.46±1.190.59±0.221.75±0.483.22±0.691ML5.38±0.863.76±0.92#0.55±0.211.82±0.412.27±0.84#CM14.31±0.83#4.16±1.090.59±0.201.85±0.292.79±0.87CM24.81±0.794.12±0.430.54±0.181.87±0.302.76±0.61CM34.62±1.013.68±0.70#0.58±0.101.82±0.132.49±0.48#

**P<0.01vsblank group;#P<0.05vsmodel group

Group Glucose/(mmol/L)0 h(mmol/L)0.5 h(mmol/L)2 h(mmol/L)AUC/(h·mmol/L)Blank4.39±0.637.29±1.034.29±0.7511.60±1.01Model5.71±0.83**14.45±3.91**8.25±2.38**22.07±5.04**Met4.73±0.64#8.45±1.75##5.00±0.71##13.38±2.06##CP4.75±0.70#10.84±3.025.05±1.06##15.81±3.01##ML5.21±0.569.84±3.26#5.46±1.67#15.24±4.34#CM14.75±0.95#9.88±2.54#5.11±0.95##14.90±2.25##CM25.09±0.6911.89±3.306.01±1.20#17.67±3.54CM34.86±1.1813.01±3.276.26±1.7918.93±4.33

*P<0.05,**P<0.01vsblank group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

3.4 青桑组方对大鼠胰岛素和胰腺组织的影响

3.4.1 青桑组方对大鼠血清胰岛素和胰岛素抵抗指数的影响 如表4所示，各组间大鼠胰岛素含量无明显差异，Met组和ML组大鼠胰岛素含量较高，与空白组相近。模型组与空白组相比，胰岛素抵抗指数升高，差异无统计学意义；而Met、CP、CM1组与模型组相比，胰岛素抵抗指数显著性降低(P<0.05)。

Group Ins/(mIU/L)HOMA-IRBlank38.56±4.067.06±1.92Model36.22±2.638.87±1.52Met38.06±4.527.32±0.90#CP36.06±4.436.86±1.54#ML38.93±6.239.35±2.19CM137.60±4.317.08±1.32#CM237.50±1.938.01±1.20CM337.04±2.987.56±1.40

#P<0.05vsmodel group

3.4.2 青桑组方对大鼠胰腺组织的影响 图1为SD大鼠胰腺组织HE染色结果。空白组大鼠胰腺组织中胰岛数量较多，呈团索状，边界清晰，细胞排列整齐。模型组大鼠胰岛体积变小，结构破坏，边界不清晰，胰岛内细胞排列杂乱，部分细胞出现肿胀，有空泡，边缘有淋巴细胞浸润，呈现出胰岛受损的状态。与模型组相比，各给药组均有不同程度的改善胰岛受损的现象。Met组和CP组的胰岛细胞排列整齐，胰岛体积有所增大，但胰岛内仍然存在空泡和少量炎性细胞；ML、CM1、CM2、CM3组的胰岛结构相对完整，边界清晰，胰岛内无明显空泡，无淋巴细胞浸润，其中ML和CM1组胰岛组织状态基本接近空白组。

3.5 青桑组方对大鼠肝肾功能的影响

3.5.1 青桑组方对大鼠肝肾功能指标的影响 如表5所示，模型组大鼠血清中ALT、AST与空白组相比略有升高，但无显著性差异；各药物组干预效果不同，其中CP、ML、CM1组肝功能指标与模型组相比显著下降，其他各组有下降趋势，但是无统计学意义。

肾功能指标检测结果显示，模型组与空白组相比BUN、CRE均较高，差异有统计学意义(P<0.01)，说明模型组大鼠的肾功能受损。除Met组外，其他药物组BUN值与模型组相比均显著性降低，ML组、CM1组、CM2组CRE值与模型组相比显著性降低(P<0.05)。以上结果提示青钱柳和桑叶可能对高脂饲料和四氧嘧啶诱导的肾功能损伤有改善作用。

Figure1 Effects of the extract mixture ofC.paliurusand Mulberry leaves on pancreatic tissue in SD rats the arrows are indicated as pancreatic islet tissue (HE,×400)

A:Blank;B:Model;C:Met;D:CP;E:ML;F:CM1 (CP-ML,3∶1);G:CM2 (CP-ML,1∶1);H:CM3 (CP-ML,1∶3)

GroupALT/(U/L)AST/(U/L)BUN/(mmol/L)CRE/(μmol/L)UA/(μmol/L)Blank42.75±8.94218.88±46.746.80±1.4935.38±5.53234.75±41.85Model46.25±9.72244.25±46.0910.15±2.47**46.38±5.13**285.13±68.43Met41.13±9.60185.75±25.78##8.91±1.8351.13±4.85231.75±68.38CP34.75±6.11#164.38±28.05##7.72±1.47#48.75±7.70260.13±62.99ML33.00±4.90##139.50±48.81##6.90±0.82##39.50±3.16##263.75±63.42CM132.50±8.43##182.00±42.52#7.46±1.44#40.38±4.63#234.00±59.94CM240.50±10.03223.38±52.747.62±1.65#39.00±8.16#225.38±44.91CM343.13±14.56211.50±52.857.47±1.94#43.75±7.34295.13±71.80

**P<0.01vsblank group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

3.5.2 青桑组方对大鼠肝组织的影响 如图2所示，空白组大鼠的肝组织中肝小叶结构完整，以中央静脉为中心，肝索呈辐射状排列，肝细胞形态正常，无炎性细胞浸润。模型组大鼠的肝小叶结构明显受损，肝细胞排列紊乱，细胞内出现脂肪空泡，并有少许炎性细胞浸润。相比模型组，药物组均不同程度的改善大鼠肝组织损伤，其中CM1组呈现为脂肪空泡明显减少，肝细胞排列整齐，肝小叶和肝索结构较完整清晰，最接近空白组大鼠肝组织形态，相比其他药物组，CM1对于肝组织的保护效果较为显著。

Figure2 Effects of the extract mixture ofC.paliurusand Mulberry leaves on liver tissue in SD rats the arrows are indicated as fatty air bubbles of liver (HE,×400)

A:Blank;B:Model;C:Met;D:CP;E:ML;F:CM1 (CP-ML,3∶1);G:CM2 (CP-ML,1∶1);H:CM3 (CP-ML,1∶3)

4 讨 论

本实验以高热能饲料联合小剂量四氧嘧啶造模，模型组大鼠体重和FBG显著升高，糖耐量异常，胰岛受损，成功诱发实验性糖尿病。与模型组相比，Met、CP、CM1组FBG指标显著性下降，Met、CP、ML、CM1、CM2组大鼠糖耐量明显改善，胰岛组织损伤减轻，各药物组肝肾组织均无明显损伤，表明青钱柳和桑叶组方后能够安全有效地控制血糖水平。

胰岛素抵抗和部分胰腺β细胞功能障碍是2型糖尿病的主要发病原因[18]。Pan等[19]发现青钱柳水提物可增加IR-HepG2细胞的糖消耗，改善胰岛素抵抗。本试验中青钱柳组胰岛素抵抗指数、空腹血糖和AUC显著降低，表明青钱柳水提物可能通过增加胰岛素敏感性发挥降血糖作用。胰腺β细胞功能障碍早期表现为胰岛素Ⅰ相分泌不足，造成餐后高血糖，引起氧化应激，损伤血管内皮，易导致心血管疾病[20]。Xu等[21]研究对比桑叶不同提取物的降血糖活性，发现其总多糖成分功效最显著。桑叶多糖还能促进四氧嘧啶糖尿病小鼠胰岛素分泌，改善其糖耐量，从而降低血糖[22]。本研究结果显示桑叶组胰岛素分泌量增加，且胰岛结构的完整性良好，糖耐量实验中0.5和2 h降低血糖效果显著，与文献报道一致。综上所述，青钱柳和桑叶组方后协同发挥降糖作用，不仅能降低空腹血糖，还能降低餐后血糖，可更好控制血糖水平。糖尿病与肥胖和高血脂症密切相关，降低血脂和体重有助于控制糖尿病病情的发展[23]。文献研究发现桑叶可以显著抑制肠道内胆固醇的吸收，降低血液黏度，从而发挥降低血脂作用[24]。本实验结果显示CP组大鼠血脂及体重控制不理想，而ML、CM3组的TC、LDL-C显著下降，说明其控制血脂效果较好，可见青钱柳和桑叶组方后更有益于糖尿病患者血脂水平的调控。

糖尿病肾病(diabeticnephropathy，DN)是糖尿病引起的危害性最大的一种慢性并发症。肾功能受损时，二甲双胍等降糖药物的药代动力学发生改变，易导致低血糖或乳酸酸中毒等不良反应，其治疗具有局限性[25]。本实验结果显示青钱柳和桑叶及其组方均能改善肾功能指标Cre、BUN，缓解肾损伤。此外，王晓红等[26]研究发现青钱柳水提物能够减少糖尿病肾病大鼠的尿蛋白排泄量，保护肾功能，减轻肾脏的负荷。陈建清等[27]发现桑叶多糖显著降低尿微量白蛋白含量、尿量及血清中Cre、BUN，缓解肾脏组织损伤。由此可见，青钱柳和桑叶组方后可以作为Met等降糖药物的辅助治疗药物，预防和改善糖尿病肾病。

综上所述，与单用青钱柳组(CP)相比，青钱柳和桑叶配伍组方的CM1组降低空腹血糖的效果与CP组相近，CM1组的胰岛组织状态明显优于CP组；与单用桑叶组(ML)相比，组方药物降血糖的效果更加明显，其中CM3组还具有与桑叶组类似的降血脂效果。由此可见，青钱柳和桑叶组方后具有更好的降糖效果，并且安全性高，适合作为辅助降血糖产品进行开发利用，但其优势配比需要进一步优选，且其降糖物质基础和作用机制还有待进一步探索。