自噬与血管钙化的研究进展

杨 蕊，朱 奕，王 颖，马文琪，王 鑫，韩熙琼，刘乃丰,4*

(1中国药科大学基础医学与临床药学学院，南京 210009；2山东省千佛山医院药学部，济南 250014；3东南大学医学院，南京 210009；4东南大学附属中大医院，南京 210009)

1963年比利时科学家Christian De Duve在溶酶体国际会议上首先提出“自噬”(autophagy)的概念，此后30年间自噬的基础研究始终没有得到重大突破，一直持续到1993年才有了阶段性进展，标志性事件是酵母自噬相关基因的发现以及酵母突变株模型的建立[1-2]。近年来伴随各种检测手段的日新月异，更多的自噬基因及其功能陆续被发现，自噬在生命科学领域的重要性和关注度与日俱增，2005年Science杂志预测自噬将会成为年度科技领域最大热点，2016年日本分子细胞生物学家大隅良典因“在细胞自噬机制方面的发现”获得诺贝尔生理学或医学奖。随着相关研究的深入开展，自噬在愈来愈多的疾病领域占据了一席之地，本文对自噬在血管钙化中的研究进展进行综述。

1 自噬概述

细胞自噬普遍存在于高等脊椎动物的真核细胞内，可通过溶酶体对细胞内蛋白质及细胞器进行降解[3-4]。自噬是一种程序化的细胞内降解过程，自噬启动后首先通过包裹降解物如线粒体、核糖体、内质网等，形成自噬体并将之运送至溶酶体，随后进行消化。自噬在维持细胞稳态、促进细胞代谢以及维持细胞器更新方面具有举足轻重的作用[5]。不同情况下，溶酶体与降解物有着不同的结合途径，主要包括：巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy)，目前研究最普遍、最充分的是巨自噬。

2 自噬的分子调节机制

在自噬进程中，首先将细胞质结构隔离在称为自噬体的双层膜囊泡内，通过融合方式递送至溶酶体进行分解，降解产物再被运回细胞质，在那里它们可以被重新用于生物合成或能量生产。通过自噬作用可将受损或不需要的细胞器(如线粒体、内质网和过氧化物酶体)靶向于溶酶体进行清除，这称之为选择性自噬。自噬过程受到30多个高度保守基因的严格调控，这些基因被称为自噬相关基因(autophagy-related genes,Atg)，Atg最初在酿酒酵母中被发现[6-7]，随后发现多数Atg在哺乳动物中具有同源性[8]。在自噬初期主要是两种复合物介导特定蛋白质向新形成的自噬体膜募集：一个复合物包括FIP200(focal adhesion kinase family interacting protein of 200 kD)与Atg1(可与Atg13、Atg101相互作用)；另一个复合体则需要PI3K(class III phosphatidylinositol 3-kinase)Vps34，其在吞噬细胞形成区域募集自噬特异性蛋白质，如Beclin1、p150/Vps15、Atg14L以及Ambra1。

自噬体的成熟需要自噬体膜的不断延伸，在膜的延伸过程中起主要作用的是两个泛素样共轭体系：Atg12-Atg5-Atg16系统和MAP1LC3(microtubule-associated protein 1 light chain 3)/Atg8/LC3。应该指出的是，根据哺乳动物的氨基酸序列同源性，可以将哺乳动物Atg8s分为两个亚组，一个是LC3亚家族，包括LC3A、3B和3C；另一个是GABARAP/GATE-16亚家族，包括GABARAP、GABARAPL1、GATE-16(也称为GABARAPL2)和GABARAPL3。这两个亚家族对于自噬过程是不可或缺的，在自噬体生物发生的早期阶段起重要作用。截至目前，LC3是被鉴别出的唯一与自噬膜相关的Atg8哺乳动物同源因子。通过Atg4家族蛋白切割pro-LC3产生LC3的胞质形式，即LC3-I，然后Atg7和Atg3介导LC3-I与PE(lipid phosphatidylethanolamine)耦合形成LC3-II[9]。由于LC3-II与自噬体特异性结合，其水平与自噬体数量相关，因此LC3-II被认为是自噬体形成的指标[10]。自噬体发生过程及相关蛋白详见图1[11]。

自噬涉及疾病发生发展的多个方面，包括发育、分化、免疫、衰老、死亡等。通常急性病理损伤情况下的自噬激活被认为是保护性的，可通过降解功能失调的细胞成分，保持细胞稳态和细胞存活；而一些慢性病诱导的持续自噬可能是有益的，也可能是有害的，如过度的自噬可能激活细胞凋亡途径或损伤重要细胞器而使得细胞死亡。目前，已发现自噬与神经退行性疾病、肿瘤、肌肉疾病、代谢综合征、病原微生物感染、衰老、心血管疾病等密切相关，其通过不同的作用机制在不同疾病中发挥着独特的作用。本文旨在讨论自噬在血管钙化中的作用。

3 血管钙化的分类及发生机制

血管钙化(vascular calcification)是普遍存在于多种慢性疾病中的共同病理表现，包括糖尿病血管钙化、慢性肾脏病、动脉粥样硬化、衰老以及血管慢性损伤等，具有显著的临床意义。钙化在血管中的发生部位存在差异，据此可将血管钙化分为：内膜钙化、中膜钙化、瓣膜钙化以及钙化的尿毒症性小动脉病变。这4种钙化类型病理生理机制各具特色，且交错重叠，如内膜钙化常与中膜钙化并存。内膜钙化，又称动脉粥样硬化性钙化，多见于大动脉，如主动脉、颈动脉等，会影响动脉管腔和血流顺畅性。中膜钙化，也称为Mönckeberg′s硬化，常见于糖尿病、慢性肾脏病、高血压、衰老等，多发生于股动脉、胫动脉、桡动脉等中小动脉。此型钙化可导致血管僵硬、顺应性下降，增加患者脉压差等。瓣膜钙化常见于代谢性疾病，如糖尿病、血脂异常、慢性肾脏病等。钙化的尿毒症性小动脉病变是一种罕见的、死亡率高的血管性疾病，常见于慢性肾脏病(尤其是终末期肾脏病透析治疗或接受肾移植的患者)、继发性甲状旁腺功能亢进、糖尿病以及使用免疫抑制剂患者。

图1自噬体发生过程及相关蛋白[11]

关于血管钙化确切的发生机制目前尚未完全清楚，既往观点认为血管钙化是一个被动的、退行性的由钙磷代谢失衡主导的钙盐在血管壁沉积的终末过程。然而，近年来大量研究发现，血管钙化类似于骨的发育代谢和软骨形成，是一个积极主动的、多因素参与的、可进行生物学调控的生理过程[12]。目前，对于血管钙化调控机制比较明确的观点包括钙磷代谢紊乱、成骨样表型转化、血管钙化调节因子失衡等[13]。本文重点讨论自噬在血管钙化进程中扮演的角色。

4 自噬与血管钙化的关系

4.1 自噬减轻电解质失衡，抑制血管钙化

钙磷失衡是血管钙化的危险因素之一，自噬作为一种动态的、高度自我调节的过程，在高磷模型中常被描述为钙沉积的保护机制[14]。Ciceri等[15]为了模拟慢性肾脏病透析患者体内过程，创建了一个新的体外模型——使用高磷间歇悬液(intermittent suspension,IS)重复、短暂的诱导血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)7～10 d，以期阐明高磷诱导的血管钙化致病机制。结果发现，与持续高磷诱导相比，高磷IS可诱导VSMC加强自噬以抵消高磷毒性，随着自噬量增加，细胞凋亡和钙化被抑制。Ciceri等[16]进一步研究柠檬酸铁对大鼠VSMC中高磷诱导血管钙化的影响，结果显示用Fe3+预处理可以抑制高磷诱导的钙沉积，并呈浓度依赖性。究其机制，Fe3+可诱导自噬增加，从而在血管钙化中起到保护作用。

4.2 自噬增加/减少基质囊泡释放，诱导/抑制血管钙化

基质囊泡在血管钙化发生发展中起到举足轻重的作用，基质囊泡的释放是血管钙化发生的起始环节[17]。当VSMC受到氧化应激、炎症、脂代谢紊乱等强烈刺激导致细胞凋亡时，来源于凋亡小体的基质囊泡便可从VSMC中释放至细胞外基质，形成易于钙磷沉积的微环境，从而启动血管钙化的发生发展[18]。Mistiaen等[19]和Somers等[20]发现在主动脉瓣退行性改变中，自噬性细胞死亡可引起基质囊泡的释放，使钙化瓣膜内自噬细胞数量减少，引发瓣膜钙化，自噬性细胞死亡是基质囊泡最重要的触发因素。随后，Dai等[14]发现，在体外高磷诱导的VSMC钙化模型中，伴有自噬表达增加，给予自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)或者敲除Atg5，钙沉积也相应增加，自噬诱导物丙戊酸则可减少VSMC钙化。进一步探讨其机制，发现3-MA显著促进高磷诱导的基质囊泡释放，并增加碱性磷酸酶活性。因此，自噬通过减少基质囊泡释放，抵消高磷诱导的血管钙化，推测自噬可能是血管钙化的内源性保护机制。该研究结果与Somers和Mistiaen等的发现存在差异，考虑与自噬所处的不同阶段和自噬程度有关。

4.3 自噬减轻氧化应激，降低血管钙化

氧化应激是当机体受到各种有害刺激时，体内活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生增多，氧化系统与抗氧化系统失去平衡，从而导致组织损伤的过程。目前已有越来越多的证据提示，氧化应激与血管钙化的发生发展存在明显的相关性[21-22]。据报道，7-酮胆固醇(7-ketocholesterol,7-KC)可促进高磷诱导的血管钙化，在此过程中自噬被抑制，Sudo等[23]发现7-KC不仅抑制自噬体和溶酶体的融合，而且还引起溶酶体溶胀，给予抗氧化剂可减轻7-KC诱导的钙化进程。因此，推测7-KC通过诱导溶酶体功能障碍，激活氧化应激，促进VSMC钙化。

4.4 自噬抑制/激活血管内皮炎症反应

炎症作为心血管疾病的非经典危险因素之一，已被大量证据证实与血管钙化的发生、发展密切相关，慢性炎症反应被认为是异位软组织钙化的核心因素[24]。研究发现，体内白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)以及C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)的水平升高与血管钙化密切相关[25-26]。目前关于自噬在炎症相关血管钙化中的研究很少，多集中于传染病、克罗恩病、囊性纤维化、肺动脉高压、慢性阻塞性肺疾病等。Pankratz等[27]发现miR-100过表达可诱导血管内皮细胞自噬显著增加，而抑制此microRNAs则具有相反作用，使LC3B阳性自噬体显著减少。同时发现抑制自噬可显著刺激核因子κB(Nuclear factor κB,NF-κB)启动子活性，因此推测自噬与NF-κB启动子具有直接的相互作用。血管紧张素Ⅱ(angiotensin II，Ang II)引起血管炎症，导致血管内皮细胞功能障碍，Yang等[28]发现Ang II可诱导组蛋白脱乙酰基酶4(histone deacetylase 4，HDAC4)表达迅速上调，血管内皮细胞中的自噬流和炎症介质随之增加。反之，HDAC4缺乏可抑制自噬激活，导致Ang II诱导的炎症减轻。使用自噬抑制剂或沉默LC3-II也减轻血管炎症，因此自噬增加血管内皮细胞中的炎症反应，与Pankratz等[27]的研究结果相左，鉴于当前相关研究较少，仍需要进一步的验证。

4.5 自噬调节脂代谢，减轻血管钙化

脂代谢紊乱在血管钙化中扮演着重要的角色，在钙化的血管细胞中三酰甘油明显增加，氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，Ox-LDL)可促进VSMC的成骨样转化，高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)则显著降低血管细胞中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性，长期给予HDL可抑制这些细胞的钙化。此外，HDL抑制IL-1、IL-6以及Ox-LDL诱导的成骨转化[29]。研究表明，自噬在脂代谢紊乱相关血管钙化进程中具有一定的作用。He等[30]报道p73(p53抑癌基因家族成员之一)可直接反式激活Atg5的启动子，从而发挥调节脂质代谢的作用。在营养匮乏时，p73缺陷小鼠的肝脏表现出大量脂滴堆积以及自噬水平降低，原因是由于自噬缺乏，甘油三酯无法水解为脂肪酸。因此自噬对于脂质正常代谢具有重要的作用。最近Ouimet等[31]提出当脂质异常沉积在巨噬泡沫细胞中，可导致动脉壁增厚及动脉粥样硬化，而脂质自噬对该钙化过程具有防御作用。体内外研究均表明当脂质负载增加时，巨噬细胞脂质自噬上调，在该通路缺陷的小鼠中，可以观察到巨噬细胞中胆固醇无法有效被清除。Qiao等[32]发现人参皂苷Rb1可减少巨噬细胞泡沫细胞和动脉粥样硬化斑块中的脂质积聚。体内外研究均证实Rb1通过激活自噬来改变斑块成分，进而增加斑块稳定性。使用Atg5小干扰RNA(siRNA)阻断自噬，可减弱Rb1对脂质堆积的调节作用。附子多糖作为一种从传统中草药附子中分离出的水溶性多糖，可通过上调自噬水平，缓解Ox-LDL诱导的VSMC钙化[33]。

4.6 β-catenin/AMPK/CREB/Nrf2-ARE/Erα等信号通路诱导自噬，减轻/促进血管钙化

自噬与血管钙化相关的信号转导通路众多[34]，如TGF-β/BMP(transforming growth factor-β/Bone morphogenic protein)、Notch、Wnt信号通路等。Wnt蛋白家族是一组由19个基因编码的高度保守的富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白，是一种重要的细胞外信号配体，Wnt信号通路参与细胞的多种生命过程，其中经典的Wnt/β-catenin信号途径可促进促钙化因子的表达，促进VSMC向成骨细胞表型转化，增加细胞内Ca2+浓度，最终启动血管钙化的发生并促进血管钙化的发展[35]。通过研究VSMC中他汀类药物抗动脉粥样硬化的分子机制发现：阿托伐他汀通过抑制β-catenin信号途径，诱导自噬增加，从而保护VSMC免受转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)刺激的钙化，给予自噬抑制剂干预可显著抑制阿托伐他汀对细胞钙化的保护作用[36]。因此，β-catenin是自噬的上游信号，自噬被诱导后，可减轻细胞钙化。

Ghrelin是胃黏膜及下丘脑的一种脑肠肽激素，是迄今发现的唯一生长激素释放激素受体的内源性配体。研究发现，在血管钙化模型中，ghrelin显著上调自噬标记物LC3和beclin1的蛋白表达，减弱碱性磷酸酶活性和钙沉积。给予自噬抑制剂3-MA可阻断ghrelin对血管钙化的改善作用。Ghrelin处理可增加磷酸化[adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK]蛋白表达，AMPK抑制剂化合物C可抑制ghrelin对自噬诱导和血管钙化的保护作用。因此研究结果提示ghrelin通过激活AMPK诱导自噬，发挥对血管钙化的改善作用[37]。饮食钾的摄入减少与多种疾病的发病有关，包括动脉粥样硬化、糖尿病和慢性肾脏病，所有这些疾病都有共同的血管并发症，如血管钙化。Sun等[38]证实，与正常钾喂养小鼠相比，减少膳食钾促进动脉粥样硬化性血管钙化和增加主动脉僵硬。相反，增加膳食钾减轻血管钙化和主动脉僵硬。进一步研究发现，低钾诱导细胞内钙升高，激活cAMP反应元件结合蛋白(cyclic-AMP response bin ding protein，CREB)信号，随后增强自噬并促进VSMC钙化。抑制钙信号或敲除CREB或Atg7减弱低钾诱导的VSMC钙化。因此CREB诱导自噬，促进钙化。

Nrf2-ARE(nuclear factor erythroid 2-related factor 2/antioxidant response element)信号通路是氧化应激和炎症的主要传感器和调节器。Nrf2是一种转录因子，其与ARE结合时有助于调节涉及细胞抗氧化和抗炎防御的相关基因表达。Ha等[39]报道血管钙化中存在高浓度Nrf2，激活VSMCs中的Nrf2可减弱血管钙化。Yao等[40]探讨了在VSMCs中，Nrf2-ARE信号通路是否能够通过调控自噬来影响血管钙化。结果表明，与高磷组相比，过表达Nrf2组自噬体和LC3II/LC3I表达升高，自噬增加，钙沉积和钙浓度降低，因此Nrf2-ARE信号通路的激活可诱导VSMCs自噬，从而减轻高磷血症诱导的血管钙化。

研究发现绝经后妇女的雌激素替代疗法可降低冠状动脉钙化程度，但其作用机制尚不清楚。Peng等[41]发现，雌激素在体外通过激活雌激素受体α(estrogen receptor alpha,ERα)信号通路增加自噬，进而抑制VSMC的成骨样分化，在体内也通过增加自噬抑制动脉钙化。给予自噬抑制剂3-MA或敲低Atg5，可抵消雌激素对动脉钙化的抑制作用，雷帕霉素进行干预则可增加对钙化的抑制作用。

5 结 语

综上所述，不同的钙化诱导因素、自噬持续时间的长短使得自噬在VSMC钙化发展中的反应不同，自噬可通过多种分子机制影响VSMC的钙化过程。但是，关于自噬与血管钙化的发生发展机制的研究仍不够全面和深入，如自噬过程的早期和晚期对血管钙化的影响是否相同？通过改变自噬过程是否可以减轻血管钙化的严重程度？这些方向的研究将会给血管钙化机制的研究以及临床防治提供新的靶点。