植物根际促生菌(PGPR)对非宿主植物猫尾草和小黑麦生长的促生作用

蒋永梅，高亚敏，姚 拓，段淇斌，赵冬青,李政璇，李海云，杨晓玫，张建贵

(1.草业生态系统教育部重点实验室甘肃省草业工程实验室中-美草地畜牧业可持续发展研究中心甘肃农业大学草业学院，甘肃 兰州 730070； 2.甘肃省农牧厅外资项目管理办公室，甘肃 兰州 730070)

近年来，土壤污染已成为全球性问题，特别是在我国，为使作物快速生长和高产，长期过量施用化肥、农药,并带来了一系列问题，如造成农产品品质下降、农业生产成本增加、土壤和环境污染、土壤肥力下降，并逐渐影响到食品安全[1]。因此，研制新型肥料以部分替代化肥来实现农业的可持续发展变得十分迫切和必要。

微生物肥料是最具替代化肥潜力的一类环境友好和低能耗型肥料，从菌种角度主要包括植物根际促生菌(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria，PGPR)类、根瘤菌(Root Nodule Bacteria)类和丛枝菌根菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi，AMF)类3种[2]。微生物菌肥较大的一个分支是促生菌肥类，植物根际促生菌指生存于植物根际、根表，并能直接或间接地促进或调节植物生长的微生物，它们通过定殖于植物根系，优先占领根际，具有固氮、溶解有机磷和无机磷、分泌植物激素和抗生素类物质的功能，从而促进植物生长发育，抑制病原菌生长，且能明显改善多年生植物连作障碍[2-7]。微生物肥料施用理念为“菌株来源于该植物，受益于该植物”，目前，研究主要集中于对施用菌肥的植物生长效果[4]，研究表明PGPR菌肥对宿主植物的株高、茎粗、植物量、叶绿素含量、根系形态等方面均有不同程度的促进作用[8]。然而，PGPR菌肥也能促进非宿主植物的生长。如：从小麦(Treiticumaestivum)、红三叶(Trifoliumpratense)、苜蓿(Medicagosativa)根际筛选出的优良PGPR制成的菌肥可显著促进油菜生长[9]；从小麦、垂穗披碱草(Elymusnatans)、苜蓿、燕麦(Avenasativa)根际筛选出优良PGPR制成菌肥，PGPR菌肥+半量化肥能够显著提高燕麦不同生育时期株高、生物量，改善根系形态特征[10]；从油菜(Brassicacampestris)、小麦、芦苇(Phragmitesaustralis)根际土壤中筛选出14株PGPR，所得菌株可定殖于豇豆(Vignaunguiculata)和番茄(Lycopersicnesculentun)根际，且促生效果较好[11]。然而，PGPR菌肥对非宿主植物的促进研究相对较少，因此，本研究以小黑麦(×TriticaleWittmack)和猫尾草(Urariacrinita)为研究对象，用盆栽试验来探究根际促生菌对非宿主植物生长的影响，以期为扩大PGPR适用范围提供基础数据和理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试植物

小黑麦品种为石大一号，猫尾草品种为岷山猫尾草，种子均由甘肃农业大学草业学院杜文华教授提供。

1.2 供试菌株

供试菌株由甘肃农业大学草业学院微生物实验室提供，从多种植物根系及根际土壤中分离筛选出10株PGPR菌，菌株编号分别为NYRS2、NCRS1、PYRS1、NCRP2、PPRS3、MCRP1、G、ZKRP1、ZKRP2、ZNHP2[12-13](表1)。

1.3 菌株组合筛选

菌株组合筛选采用平板对峙法[14-15]。

1.4 菌肥的制作

1.4.1载体配方 菌肥载体具体配方详见参考文献[4]。

1.4.2菌悬液制备 根据菌株间拮抗反应、菌株促生特性及菌株生长速度等特性，筛选获得最佳菌株组合，分别将菌株接种至LB液体培养基中，置于摇床上振荡48 h(180 r·min-1)，备用。

1.4.3菌肥制作 菌肥载体具体配方详见参考文献[4]。本试验菌肥栽体(泥炭∶木炭∶花土=2∶2∶1)施用量为每110 g土中17 g。

表1 供试菌株特性Table 1 Characteristics of tested strains

1.5 试验设计

2016年11月在甘肃农业大学温室中进行盆栽试验。选用颗粒饱满且大小一致的小黑麦、猫尾草种子，用1%的NaClO溶液灭菌10 min后，用无菌水清洗3次，然后种植于一次性塑料杯中(规格：外径9.5 cm×内径8.5 cm×高12 cm)，每杯装110 g无菌花土，种植小黑麦10株·杯-1，猫尾草30株·杯-1，每种植物种植20杯。试验共设置4个处理：不施肥(CK)；施宿主植物生物菌肥(NF1)，宿主植物菌肥由甘肃农业大学草业学院微生物实验室提供，施肥量为每个塑料杯17 g菌肥载体(有效活菌数2×109cfu·g-1)；施非宿主植物生物菌肥(NF2)，由1.2中筛选最佳菌株制作的菌肥，施肥量同NF1；施化肥(磷酸二铵)，施肥量为每杯0.15 g磷酸二铵+17 g空白载体。每个处理重复5次，并将5次重复放在27 cm(长)×18.5 cm(宽)×8.5 cm(高)的白色保鲜盒中，用保鲜膜对塑料杯口密封，待种子长出两片叶子时，将保鲜膜取掉，在每个白色保鲜盒中每2 d浇300 mL无菌水，一周浇300 mL营养液，待植物生长50 d左右，测定各项指标。

1.5.1指标测定及方法 株高(cm)：每个塑料杯中随机选取5株，用直尺测定自然高度[16]；茎粗(mm)：每个塑料杯中随机选取3株，用游标卡尺测量茎粗[17]；叶绿素含量(%)：每个塑料杯中随机选取5个植物叶片，用叶绿素仪(Soil and Plant Analyzer Development 502，SPAD-502)进行测定；生物量(g)：每个塑料杯中随机选取10株，将植株地上、地下部分分开采集，装入自封袋，用电子天平分别称量地上、地下植物鲜重，后装入信封中置于烘箱10 h(105 ℃)，待植物完全烘干后分别称取地上、地下干重[18]；根系形态：采用根系扫描仪(LA2400 Scanner，Epson Expression 1000XL)对植物根系进行扫描，获得总根长、根表面积、根平均直径、根体积及不同根直径下的总根长等参数[19]。

1.6 数据处理

采用SPSS 19.0和Excel 2010软件进行数据分析和作图(数据均以平均值或平均值加标准误表示)，并通过One-Way ANOVA和Duncan法进行显著性分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 菌株组合筛选

2.1.1供试菌株之间的拮抗反应 已选择的10株优良PGPR菌株，综合固氮、溶磷、分泌激素、生防等特性，采用平板对峙法测定菌株间拮抗性，各菌株间两两进行组合，每个组合重复3次，所得结果如表2列。

2.1.2菌株对病原菌的抑制效果 从10株供试菌株中筛选出6株拮抗菌(表3)，所筛选的拮抗菌株对不同病原菌防治效果不同，其中对病原菌抑菌率大于50%的菌株有NCRP2、NYRS2，其余菌株对病原菌的抑菌率均小于50%。其中，NCRP2菌株对小麦长蠕孢菌(Helminthosporiumtritici-vulgaris)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumn)、马铃薯立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、油菜菌核菌(Sclerotiniasclerotiorum)和玉米小斑病菌(Bipolariamaydis)抑制效果较好，可见NCRP2对病原菌防治具有广谱性。

根据PGPR菌株特性(表1)、菌株间的拮抗反应及其对病原菌的抑制作用(表2、表3)，从中筛选出最佳菌株组合为NCRP2+PPRS3+G+ZKRP2，按照1.4操作步骤制作菌肥，并进行盆栽试验。

2.2 生物菌肥对小黑麦和猫尾草株高的影响

与不施肥(CK)相比，NF1处理能够促进小黑麦生长，提高小黑麦的株高，但影响不显著(P>0.05)，化肥可以增加小黑麦株高，经NF2处理的小黑麦株高最低，但NF2和化肥处理对小黑麦株高无显著影响(P>0.05)。与不施肥(CK)相比，不同施肥处理不增加猫尾草株高，除NF2对猫尾草的株高有显著负影响(P<0.05)外，其他不同施肥处理对猫尾草株高影响没有显著性差异(P>0.05)。由此可见，NF2生物菌肥对非宿主小黑麦株高没有显著影响，但对猫尾草株高有显著负影响(图1)。

2.3 生物菌肥对小黑麦和猫尾草茎粗的影响

不同处理间小黑麦茎粗均表现无显著性差异(P>0.05)，各处理对小黑麦茎粗影响总体表现为NF2>NF1>化肥>CK，且NF2与NF1相比，NF2处理使小黑麦茎粗增加了6.79%(图2)。与CK相比，其余处理均显著增加猫尾草茎粗(P<0.05)，其中NF2和化肥处理影响最大，两者之间无显著性差异(P>0.05)，但与其余处理均有显著性差异(P<0.05)，各处理对猫尾草茎粗总体表现为NF2=化肥>NF1>CK，且NF2与NF1相比使茎粗增加33.74%。由此可见，化肥、NF2、NF1处理均具有促进猫尾草茎粗的作用。

表2 菌株组合筛选结果Table 2 Result of strain combination screening

“+”表示菌株间无拮抗关系。

“+”means that there is noantagonistic relationship between different strains.

表3 PGPR菌株对病原菌的抑制效果Table 3 Inhibition effect of bio-control PGPR against pathogen

图1 生物菌肥对小黑麦、猫尾草株高的影响Fig. 1 Effect of biological fertilizer on plant height of ×Triticale Wittmack and Uraria crinita

不同小写字母表示不同施肥处理间差异显著(P<0.05)。NF1,宿主植物菌肥；NF2，非宿主复合菌肥。下同。

Different lowercase letters indicate significant difference under different fertilization treatmentsat at the 0.05 levels; NF1, host plant bio-fertilizer; NF2, Non-host compound bio-fertilizer; similarly for the following figures and tables.

图2 生物菌肥对小黑麦、猫尾草茎粗的影响Fig. 2 Effect of biological fertilizer on stem diameter of ×Triticale Wittmack and Uraria crinita

2.4 生物菌肥对小黑麦和猫尾草叶绿素含量的影响

与不施肥(CK)相比，各施肥处理对小黑麦、猫尾草叶绿素含量没有显著性影响(P>0.05)，试验处理并没有引起小黑麦叶绿素含量的显著改变。各施肥处理对猫尾草叶绿素含量的影响总体表现为NF2>CK>化肥>NF1，与NF1相比NF2可使猫尾草叶绿素含量增加13.72%(图3)。

2.5 生物菌肥对小黑麦和猫尾草生物量的影响

与不施肥(CK)相比，生物菌肥及化肥处理均能提高小黑麦地上生物量鲜重(图4)，NF1处理对小黑麦地上鲜重具有显著性影响(P<0.05)，与其余不同施肥处理对小黑麦地上鲜重间没有显著性影响(P>0.05)，总体表现为NF1>NF2>化肥>CK，且NF1与NF2相比小黑麦地上生物量鲜重增加0.89%；与不施肥(CK)相比，不同施肥处理对小黑麦地上生物量干重、地下生物量鲜重和干鲜重均没有显著性差异(P>0.05)，且不同施肥处理间也没有显著性差异(P>0.05)。不同施肥处理对猫尾草地上、地下生物量干鲜重的影响与小黑麦基本保持一致。

图3 生物菌肥对小黑麦、猫尾草叶绿素含量的影响Fig. 3 Effect of biological fertilizer on chlorophyll content of ×Triticale Wittmack and Uraria crinita

图4 生物菌肥对小黑麦、猫尾草生物量的影响Fig. 4 Effect of biological fertilizer on the biomass of ×Triticale Wittmack and Uraria crinita

2.6 生物菌肥对小黑麦和猫尾草根系形态的影响

不同施肥处理对小黑麦根系形态的影响总体表现为NF2>化肥>NF1>CK，对根平均直径和根体积影响除外(表4)。与不施肥(CK)相比，NF1、NF2和化肥处理对小黑麦总根长、根表面积均没有显著影响(P>0.05)，NF2处理和化肥对根平均直径和根体积影响显著(P<0.05)，其中NF2处理的总根长、根表面积、根体积最大，分别为217.94 cm、11.78 cm2、0.35 cm3，与CK相比分别增加了27.54%、8.97%、118.75%。

与不施肥(CK)相比，NF1、NF2和化肥处理对猫尾草根系总根长、根表面积、根体积均没有显著性差异(P>0.05)，NF1处理对根平均直径影响显著(P<0.05)，即生物菌肥NF1对猫尾草根生长有一定的抑制作用，影响根的平均直径(表5)。

2.7 生物菌肥对小黑麦和猫尾草不同根直径下的总根长影响

与不施肥(CK)相比，NF2和化肥处理对小黑麦根直径0.5～1.0、1.0～1.5 mm的根长有显著影响(P<0.05)，NF1、NF2和化肥处理对>1.5 mm根长没有显著影响(P>0.05)；NF1处理对0～0.5 mm根长具有抑制作用。综上可见，NF2处理与NF1处理相比，NF2处理对小黑麦细根的总根长影响较大(表6)。

表4 生物菌肥对小黑麦根系形态的影响Table 4 Effect of biofertilizer on root morphology of ×Triticale Wittmack

表5 生物菌肥对猫尾草根系形态的影响Table 5 Effect of biofertilizer on root morphology of Uraria crinita

表6 生物菌肥对小黑麦不同根直径下的总根长影响Table 6 Effect of biofertilizer on total root length of different root diameter of ×Triticale Wittmack cm

4个处理对猫尾草根直径0～0.5、0.5～1.0、0.5～1.0、>1.5 mm的根长均没有显著性差异(P>0.05)，但NF2处理对>1.5 mm根长影响最大。故生物菌肥对根系的生长具有明显影响(表7)。

表7 生物菌肥对猫尾草不同根直径下的总根长影响Table 7 Effect of biofertilizer on total root length of different root diameter of Uraria crinita cm

3 讨论

在农牧业生产中，施用生物菌肥对不同植物株高、茎粗、生物量、叶绿素含量、根系形态、抗病性等方面均有不同程度影响，且表现出化学肥料所没有的优势。有研究表明,PGPR菌株接种宿主植物黄瓜(Cuoumissativus)、玉米(Zeamays)的株高和鲜重可分别提高8.63%～11.39%和6.3%～10.1%[20-21]。而将PGPR菌接种到非宿主植物，紫花苜蓿和蚕豆(Viciafaba)株高可提高65.37%～65.50%[22-23]，马铃薯(Solamumtubenxum)和蚕豆植物量提高17.91%～37.69%，蚕豆侧根和毛根分别提高22.54%～23.77%和0.96%～5.87%[23]，桂花(Osmanthusfragrans)苗叶绿素含量增加9.85%[24]。本研究结果表明,施用非宿主植物菌肥(NF2)后，小黑麦毛细根、猫尾草茎粗均有增加，小黑麦、猫尾草地上生物量鲜重增加33.4%和38.41%。黄瓜施用PGPR菌肥后株高和鲜重分别提高11.39%和8.63%[20]，本研究结果与秦士娇等[20]研究相比效果较好。然而植物养分吸收更依赖根长和根表面积而不是总根生物量[25]，可能是因为菌肥(NF2)中含有巴西固氮螺菌(Azopsirillumbrasilense)和短小芽胞杆菌(Bacilluspumilus)，能够快速定殖且分泌植物激素，刺激禾本科毛细根生长，分蘖数增加，而根的增加可使植物从土壤中吸收更多的水分和营养，以支持植株生长，增加植物量[26]。本研究表明，施用菌肥NF2后，小黑麦叶绿素含量NF2比CK低1.29%，猫尾草叶绿素含量比CK提高9.60%。叶绿素含量与氮素营养吸收有关,豆科植物猫尾草自身特性决定吸收氮素较多，且NF2中的乙酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)定殖能力在猫尾草上较差，而在小黑麦上较强，因此猫尾草叶绿素含量上升而小黑麦叶绿素含量下降[27]。然而施用NF2后会显著减小猫尾草的株高，使其减少24.86%。韩光等[22]施用复合型PGPR菌肥后，发现紫花苜蓿(非宿主植物)株高可提高65.37%～65.50%，其结果与本研究相反，造成这一现象的原因可能是由于猫尾草根系分泌物影响到PGPR菌的定殖，从而影响植株对养分的吸收，造成猫尾草株高的减小。

总之，本研究结果表明，PGPR菌肥能够促进非宿主植物的生长，影响植物的株高、茎粗、植物量、叶绿素含量、根系形态，但具体促生机理还有待进一步研究。

4 结论

本研究筛选出的适合小黑麦和猫尾草的菌株最佳组合为NCRP2+PPRS3+G+ZKRP2。小黑麦、猫尾草地上生物量鲜重在NF2处理、NF1处理、化肥处理下差异不显著，但与CK处理相比差异显著(P<0.05)，且NF2处理与CK相比分别增加22.35%和52.52%。与对照CK相比，施用菌肥NF2，小黑麦根平均直径、根体积分别增加22.54%和118.75%，且差异显著(P<0.05)；且NF2处理对直径0.5～1.0和1.0～1.5 mm小黑麦根长影响显著(P<0.05)。新制作的非宿主植物菌肥对小黑麦和猫尾草生长具有促进作用。