青海审定小麦品种抗叶锈病基因的分子鉴定

刘 韬，吴丽军，甘晓龙，张 波，刘宝龙，陈文杰，张连全，刘登才，张怀刚,4

(1.中国科学院 西北高原生物研究所，西宁 810008； 2.四川农业大学 小麦研究所，成都 611130；3.中国科学院大学，北京 100049；4.青海省作物分子育种重点实验室，西宁 810008)

小麦叶锈病(Wheat leaf rust)作为小麦的三大锈病之一，是由小麦叶锈菌(Pucciniatirticina)引起的真菌病害，影响小麦的产量和品质，对小麦生产具有极大威胁，严重爆发时减产50%[1-4]。研究培育小麦叶锈病抗病品种是小麦生产上最为经济和安全有效的方法。全面了解目前生产小麦品种的抗叶锈性及其所含有的抗叶锈基因、发掘新的叶锈病抗源已经成为有效控制小麦叶锈病害的一个重要环节。

至今，国际上已发现抗小麦叶锈病基因超过100个，其中正式命名的有72个[5]。大部分已分子作图并获得紧密连锁或共分离的分子标记。Temam等[6]利用RILs定位14个小麦抗叶锈基因 Lr1、Lr9、Lr10、Lr19、Lr20、Lr24、Lr27、Lr31、Lr32、Lr34、Lr35、Lr40、Lr46、Lr47，其中， Lr34、Lr35和 Lr46为成株抗性位点。Baszczyk等[7]对 Lr9、Lr19、Lr20、Lr21、Lr24、Lr25、Lr26、Lr28、Lr29和 Lr37的分子标记在小麦抗叶锈病育种中进行有效验证，发现除 Lr21和 Lr25的分子标记以外都具有高度特异性；Vida等[8]对 Lr9、Lr24、Lr25、Lr29、Lr35和 Lr37的分子标记进行鉴定，认为这些分子标记可以有效地检测到未知背景的小麦品种所含有的抗叶锈病基因。 Lr9来源于小伞山羊草，对中国叶锈病优势小种表现极高的抗性，在生产上有很大利用价值[9]。

近年来，随着全球气候变化，青海也变得湿润多雨，成为小麦锈病的繁育地。而叶锈菌孢子对环境的适应能力强于条锈菌和秆锈菌孢子，既耐低温也耐高温。因此，叶锈病入侵青海并爆发将成为可能。2017年6月，中科院西北高原生物研究所张怀刚课题组在青海西宁周边考察时发现，西宁大通县长宁镇(N36°49′，E101°45′)种植的部分小麦感染叶锈病(图1)，不过未大规模爆发。所以了解青海当地审定小麦品种抗叶锈基因的分布状况，通过基因聚合培育抗叶锈病品种非常迫切。

图1 发现于青海西宁的叶锈病感病株叶片Fig.1 Wheat leaf rust detected in Xining,Qinghai province

本研究利用与6个抗叶锈基因紧密连锁的分子标记，对青海省审定的66个小麦品种进行抗叶锈基因检测，调查青海省当地普通小麦品种叶锈病抗性基因的分布情况，以期为小麦叶锈病抗病育种提供材料和理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

青海省审定的小麦品种66份(表1)。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 采集小麦新鲜叶片，在液氮中冷冻研磨后，用CTAB法[10]提取基因组DNA，用微量紫外检测仪NANODROP2000C(Thermo)测量DNA质量浓度。将DNA均稀释到200 mg/L，用10 g/L的琼脂糖胶在110 V电压下电泳30 min，检测DNA的质量。

1.2.2 特异性引物的选择 小麦抗叶锈病基因 Lr1[11]、 Lr9[12]、 Lr24[13]、 Lr29[14]、 Lr34[15]、 Lr42[16]是目前发现的能够有效抵抗小麦叶锈病的抗性基因。上述基因已经被分别定位到小麦染色体上： Lr1 定位到5DL[17]， Lr9 定位到6BL[17]， Lr24 定位到3DL[17]， Lr29 定位到7DS[17]， Lr34 定位到7DS[17]， Lr42 定位到1D[16]。根据查阅相关NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)、GrainGenes2.0(https://wheat.pw.usda.gov)、参考文献得到与抗性基因相应的引物序列22对，通过试验对比，选取稳定性比较高的6对引物(表2)进行相应的抗性基因扩增，各引物目的片段大小见表2。引物均由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增以及电泳检测 用6对引物对66份小麦品种的基因组进行PCR扩增分析。PCR扩增体系(20 μL)为：10×Taqbuffer(200 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2) 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，2.5 U/μLTaqDNA polymerase 0.4 μL，各引物正反序列均为5 pmol，DNA 200 ng。PCR程序为：95 ℃变性4 min，然后35个循环95 ℃变性30 s，55 ℃～68 ℃复性(各引物根据试验前期摸索的最适退火温度确定)30 s，72 ℃延伸30 s～1 min(根据目的片段大小确定)，最后72 ℃延伸10 min。不同的PCR产物根据各基因目的条带大小，制作各自的琼脂糖分离胶或PAGE胶；然后琼脂糖胶在TAE缓冲液中，110 V电压下，电泳30 min；取出后在凝胶成像仪中拍照保存。而PAGE胶在TBE缓冲液中，160 V电压下，电泳2 h，将胶在置于含EB的TBE溶液(10 μL∶100 mL)中浸泡10 min，取出后在凝胶成像仪中拍照保存。

表1 66份青海省审定小麦品种Table 1 66 wheat cultivars released in Qinghai province

表2 微卫星引物Table 2 SSR markers

2 结果与分析

2.1 SSR引物的筛选及最适退火温度的确定

由于参考文献和数据库中给出的引物有多对，最终筛选到最适合的6对引物和其最适退火温度(表2)： Lr1的引物WR003，63 ℃； Lr9的引物J13，68 ℃； Lr24的引物S1302-609，55 ℃； Lr29的引物OPY10，60 ℃； Lr34的引物CSLV34，55 ℃； Lr42的引物Wmc432，55 ℃。

2.2 各抗性基因在普通小麦中的分布

分别用确定的6对引物及最适退火温度对66份青海审定小麦品种分别进行PCR扩增检测，部分电泳图如图2，结果发现(表3)，在66份小麦品种中，有16份含有 Lr1，占24.24%；有18份含有 Lr24，占27.27%；有31份含有 Lr29，占46.97%；有5份含有 Lr34，占7.58%；有23份含有 Lr42，占34.85%。

在66份青海青海审定小麦品种中均未检测出 Lr9抗性基因(表3)。结果还发现，在检测的小麦品种中同时含有2个抗性基因的品种有17份(表3)，占25.76%；同时含有3个或3个以上的品种有9份，占13.64%(表3)。综上可以看出，同时含有多个抗叶锈病基因的品种很少，每个品种的抗叶锈病基因过于单一。

M1.1 kb plus DNA ladder；M2.50 bp DNA ladder；1-18.部分检测样品 Some detected samples

表3 66份青海审定小麦品种抗叶锈基因检测结果统计Table 3 Molecular detection results of leaf rust resistance genes in 66 wheat cultivars released in Qinghai province

(续表3 Continued table 3)

3 讨 论

在中国，叶锈病发病地主要为长江流域，多为西南和华东地区。但近年来，随着全球气候变暖，青海也变得湿润多雨，逐年成为小麦锈病的繁育地。叶锈病对环境的适应能力强于条锈病和秆锈病，既耐低温也耐高温。因此，叶锈病入侵青海并突然爆发将成为可能。2017年7月对西宁周边区县进行调查时发现，在西宁大通县长宁镇发现小麦叶锈病感病株(图1)。虽后期未见该病在西宁周边爆发，但这一现象足以说明青海部分地区已逐渐满足小麦叶锈病的发病条件。本研究以66份青海省审定的小麦品种为试验材料，结果发现有10份材料不含有以上6种任何一种抗性基因，32份供试材料只含有其中1种抗性基因，研究结果表明：对青海省春小麦主栽品种‘阿勃’和‘高原448’[18]而言，‘高原448’不含以上6个抗叶锈病基因的任何一个，而‘阿勃’也只含有1个(表5)。这是一个危险信号，一旦小麦叶锈病孢子的某小种适应青海气候环境，极有可能引起叶锈病在青海爆发，导致小麦减产和品质下降。本研究也有不足之处，结论有可能不准确，因为目前抗叶锈病的基因还未完全发现，这些小麦品种中可能存在未曾检测到的其他抗叶锈病基因。

本研究的另一结果表明，供试材料中含有的抗性基因极其单一，42份不含有或只含有1个抗性基因，占供试材料的63.64%。因此，引进、发掘和合理利用优良种质资源，使一个品种同时聚合多个抗性基因，提高小麦抗性基因的多样化，是防治小麦叶锈病的有效措施。

本研究明确了青海审定66份小麦品种的抗叶锈性及其抗叶锈基因的单一性等问题，为小麦种质的抗叶锈性评价提供基础信息；同时，也为青海省的小麦抗病育种提供依据和材料。