输血相关急性肺损伤动物模型的建立及可溶性CD40配体在其发生机制中的作用

胡 嫒，陈唯韫，黄宇光

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院麻醉科，北京 100730

输血相关急性肺损伤(transfusion-related acute lung injury，TRALI)是指输入血液或血制品后6 h内发生的以低氧血症和急性非心源性肺水肿为主要表现的临床综合征[1]。TRALI起病急、病情重、病死率高[2]，已成为输血导致死亡的主要原因之一[3]，但其具体的病理生理学机制尚未完全阐明，二次打击学说为目前最为接受的假说[4]，该学说认为TRALI的发生包括二次打击，第一次打击即患者自身潜在的医学情况如脓毒症、手术创伤可诱导中性粒细胞聚集、黏附于肺血管内皮细胞，使中性粒细胞处于预备状态[5- 10]；第二次打击即输血本身可使已处于预备状态的中性粒细胞激活，进而诱发TRALI[11]。目前，研究者主要通过动物模型研究TRALI的发生发展过程，验证各种假说，进而推用到人，以指导疾病的诊断和治疗。因此，建立行之有效的动物模型成为TRALI研究必不可少的关键步骤。近年来，以脂多糖诱发的活动性感染作为第一次打击事件被广泛用于TRALI模型[12- 14]，但是这一模型并不能很好地模拟手术应激以及术中大量失血这一临床情况。在第一次打击的基础上，库存血中的白细胞抗体、生物反应调节因子等可作为第二次打击，使处于触发状态的中性粒细胞激活并导致TRALI发生[11，15]。其中，多数研究认为主要由血小板衍生的促炎介质可溶性CD40配体(soluble CD40 ligand，sCD40L)可作为第二次打击事件诱发TRALI[16]。本研究拟通过创伤-失血-大量输血的方法建立TRALI动物模型并检测sCD40L含量，以进一步研究其在TRALI发生中的作用。

材料和方法

实验动物无特定病原体级雄性Lewis大鼠，体重300～350 g，由北京协和医院动物实验中心饲养和提供，标准饲料、饮水，垫料及一切物品均经无菌处理。所有动物实验均通过北京协和医院实验动物伦理审查并批准。

主要试剂与耗材戊巴比妥钠(北京博奥拓达科技有限公司)、血液保存液(Ⅲ)(CPDA- 1)(四川南格尔生物科技有限公司)、0.9%生理盐水(中国大冢制药公司)、乳酸林格钠液(上海百特医疗用品有限公司)、0.5%伊文斯兰染液(北京索莱宝科技有限公司)、酶联免疫试剂盒(北京易科拜德科技有限公司)、套管针(德国贝朗医疗有限公司)、采血袋(山东威高集团医用高分子制品股份有限公司)。

大鼠浓缩红细胞的制备1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，22G套管针行一侧颈动脉置管，连接三通、20 ml注射器，缓慢抽取大鼠血液。将大鼠全血转移至含有CPDA- 1的离心管中(CPDA- 1终浓度为14%)，3000 r/min(转子半径16 cm)离心30 min，分离血浆，去白膜法去除白细胞，将获得的大鼠浓缩红细胞(packed red blood cell，PRBC)转移至25 ml一次性采血袋中，4℃保存备用。为满足建模需要，共分4次制备浓缩红细胞待用。

大鼠TRALI动物模型的建立实验共Lewis大鼠27只，采用随机数字表法将大鼠随机分成正常对照组、生理盐水(normal saline，NS)对照组和7 d PRBC组，每组各9只大鼠。1%戊巴比妥钠间断腹腔注射麻醉大鼠，7 d PRBC组和NS对照组大鼠予24G套管针(肝素抗凝)行股动静脉置管，股动脉置管用于采血及血压监测，股静脉置管用于补液、输血。置管后待大鼠恢复15～30 min，血压平稳后采集大鼠全血的30%(以大鼠体重的7%计算全血)，1 h休克期后，采用乳酸林格钠液予大鼠补液(补液量为失血量的2倍)，并于40 min内输注完毕，经股静脉注射伊文斯兰染液(Evans blue dye，EBD)(30 mg/kg，在1 min内输注完毕，仅在用于测定EBD漏出量的7 d PRBC组及NS对照组大鼠中注射)后，分别输注储存7 d的红细胞和生理盐水(7 d PRBC组和NS对照组)。红细胞输注量(ml)=大鼠基础红细胞比容/该袋PRBC红细胞比容×失血量(ml)，将浓缩红细胞与生理盐水混合，其总体积应与失血量相同并于30 min内输注完毕；NS对照组则输注等量NS。正常对照组大鼠仅予1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉并观察6 h后采血，采血量为8～10 ml，血液经3000 r/min离心25 min，分离血浆-20℃保存备用，采血后大鼠因失血过多而死亡。

根据现有诊断标准发生TRALI的最长时间，7 d PRBC组和NS对照组大鼠在输血(或输注NS)后最长观察至6 h，即若大鼠在6 h内出现呼吸窘迫甚至死亡，则在死亡前进行采血，若大鼠未发生死亡，则观察至6 h采血。

建立TRALI模型后，每组各3只大鼠用于病理学检查，其余6只用于支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)蛋白漏出量、EBD漏出量及血浆sCD40L含量测定。

动物模型的验证

观察大鼠肺组织病理学改变：大鼠死亡后取大鼠右侧肺组织福尔马林固定，依次包埋、切片、行HE染色，观察大鼠是否存在典型的TRALI病理学改变。

测定BALF中蛋白漏出量：大鼠死亡后以0.9%生理盐水行支气管肺泡灌洗，每次5 ml，共3次，灌洗液-20℃保存备用。采用BCA法测定BALF中总蛋白含量，7 d PRBC组与NS组、正常对照组相比有统计学意义即认为7 d PRBC组大鼠发生肺水肿。

测定EBD漏出量：分别测定7 d PRBC组与NS对照组大鼠血浆和BALF在620 nm波长处的吸光度，用以下方法计算EBD漏出量：EBD漏出量(%/min)=BALF中EBD含量/血浆中EBD含量/输血后时间(min)。二者相比差异有统计学意义即认为7 d PRBC组大鼠发生肺水肿。

库存血及大鼠血浆sCD40L含量测定：采用大鼠sCD40L ELISA试剂盒检测不同批次及保存时间不同的库存血(4个批次分别保存0 d、7 d PRBC)及研究中各组大鼠血浆sCD40L含量。

统计学处理采用SPSS 17.0进行统计学分析，数据用均数±标准差表示，两组比较用独立样本t检验，3组比较用单因素方差分析，组间比较采用Bonferroni校正，P<0.05为差异有统计学意义。采用GraphPad Prism5进行图像处理[17]。

结 果

一般情况观察时间内所有大鼠均存活，7 d PRBC组大鼠较NS组及正常对照组无呼吸频率增快、血压降低表现。

肺组织病理学改变正常大鼠肺组织肺泡上皮细胞形态正常，肺泡间隔未见增宽，肺间质未见炎性细胞浸润，NS对照组较正常对照组无改变，7 d PRBC组大鼠肺组织可见肺泡上皮细胞增生，肺泡间隔增厚，间质大量炎性细胞浸润(图1)。

BALF蛋白漏出量7 d PRBC组大鼠BALF蛋白漏出量与正常对照组及NS对照组比较差异有统计学意义(F=17.605，P<0.001)。多重比较结果显示7 d PRBC组大鼠BALF蛋白漏出量(13.17±5.76)mg明显高于正常对照组(1.21±0.66)mg(P<0.001)及NS对照组(4.94±2.15)mg(P=0.004)；NS对照组与正常对照组相比差异无统计学意义(P=0.271)。

EBD漏出量7 d PRBC组大鼠EBD漏出量(0.0109±0.0067)%/min明显高于NS对照组(0.0026±0.0006)%/min(t=2.998，P=0.03)。

库存血中sCD40L含量储存7 d PRBC中sCD40L含量(451.58±73.28) pg/ml明显高于储存0 d PRBC中sCD40L含量(277.94±98.18)pg/ml(t=2.834，P=0.03)。

血浆sCD40L含量7 d PRBC组大鼠血浆sCD40L含量与正常对照组及NS对照组相比差异有统计学意义(F=78.715，P<0.001)。多重比较结果显示7 d PRBC组大鼠血浆sCD40L含量(878.21±125.30)pg/ml明显高于正常对照组(289.78±62.60)pg/ml(P<0.001)和NS对照组(418.07±47.68)pg/ml(P<0.001)；NS对照组和正常对照组比较差异无统计学意义(P=0.06)。

NS：生理盐水；PRBC：浓缩红细胞

NS：normal saline；PRBC：packed red blood cell

A. 正常对照组；B. NS对照组；C. 7 d PRBC组

A. normal controls；B. NS-treated group；C. 7 d-PRBC-treated group

图1大鼠肺组织HE染色(×10)

Fig1HE staining of the lung tissue of rats (×10)

讨 论

本研究采用创伤-失血-大量输血的方法成功建立了TRALI大鼠模型，并通过大鼠肺组织病理学、BALF蛋白漏出量及EBD漏出量的检测证实肺水肿的发生，验证了建模成功。该方法较腹腔注射脂多糖的化学诱导建模法更好地模拟了临床TRALI发生的病理生理过程，更符合临床实际情况。同时，与Nicholson等[18]报道的建模方法比较，本方法的优势在于：(1)第一次打击联合创伤打击与失血打击，更好地模拟了临床外科手术创伤失血这一情境；(2)以间断腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，较异氟烷麻醉法更简单易行且环保；(3)经过实践，将手术创伤后大鼠恢复时间由16 h缩减至15～30 min，提高了建模效率。

本研究也尝试用贮存时间更长的PRBC建立TRALI模型，以期更好地模拟临床情境，但在前期实验中，大鼠输注21 d PRBC后立即死亡。由于大鼠PRBC较人PRBC更易发生存储病变[19]，大鼠死亡原因可能有：(1)输注21 d PRBC后发生严重TRALI导致大鼠立即死亡；(2)随着贮存时间延长，PRBC中血钾过高，受血大鼠因高钾血症死亡。因此，本研究尚未建立输注储存时间更长的PRBC的TRALI动物模型，待后续实验进一步完善。

主要由血小板衍生的促炎介质sCD40L在TRALI发生发展中的作用尚存在一定争议。有研究证实，sCD40L可作为第二次打击事件激活中性粒细胞进而诱发TRALI[16]。也有部分研究者认为sCD40L与TRALI的发生无相关性[20]。这些结果均为在细胞实验或脂多糖动物模型，或小样本TRALI患者血标本研究中所得到的。实际临床工作中，对于红细胞制剂的需求远大于血小板和血浆，因此，TRALI相关死亡最多见于输注红细胞，且研究证实红细胞较血小板更易引起TRALI的发生[21]。此外，研究显示sCD40L含量在所有库存血中均有所升高[16]。因此，研究红细胞存储过程中，sCD40L的改变以及sCD40L与TRALI的发生之间的相关性具有一定临床意义。本研究在以创伤-失血-大量输血方法建立的更符合临床实际情况的TRALI动物模型中，通过检测库存血及TRALI大鼠血浆中sCD40L含量两项指标验证sCD40L在TRALI发生中的作用，结果显示库存血中sCD40L含量随存储时间的延长而增加；且7 d PRBC组大鼠血浆中sCD40L含量较NS对照组及正常对照组明显增加，提示sCD40L可能在TRALI发生发展中具有一定作用。

综上，本研究改良了创伤-失血-大量输血的方法，成功建立更符合临床病理生理过程的TRALI动物模型，在该模型中的进一步研究提示sCD40L在TRALI发生中可能具有一定作用。在后续实验中可以利用这一模型继续探究sCD40L诱发TRALI的其他可能通路以及TRALI发生的其他可能机制，为TRALI发生机制的研究及治疗策略提供新思路。