陈皮雪梨发酵灵芝菌种复合饮料的条件优化及其抗氧化性研究

辛燕花，张铁丹，刘阳,张建华，连广平

(1.忻州师范学院 生物系,山西 忻州 034000； 2.万物生健康产业有限公司,广东 广州 510642)

灵芝[Ganodermalucidum] 是一种历史悠久，具有多种生理调节功能的珍贵食药用菌[1]。灵芝可以保护肝脏，抗肿瘤，抗艾滋病病毒及艾滋病病毒的蛋白酶活性，影响组织胺的释放，抑制血管紧张素的形成，对人体的免疫系统进行调节等[2～3]。陈皮是一种经晒干或干燥后的果皮，多为芸香科植物的成熟果实。橙皮苷是陈皮中的主要成分之一，有较强的生理调节功能，如抗脂质氧化、抗病毒、抗癌、延缓衰老等[4]。雪梨含有多糖和多种酯类等物质，因此具有多种生理调节功能[5]。

近年来，灵芝相关产品的研究和生产越来越多，主要得益于其丰富的营养价值。对于以灵芝为原料研发的发酵型饮料在市场不常见，研究较为缓慢滞后。有研究者通过添加豆渣发酵灵芝菌丝体得到的发酵液制备的果汁色泽和组织形态较好，但口感较粗糙[6]。还有一些灵芝饮料多数直接采用子实体为原料进行生产，导致灵芝本身的营养成分和生理功能并没有全部被开发出来。研究表明，相比其他饮料，发酵型的食用菌功能饮料有其独特的优势，经深层发酵后的食用菌功能饮料保留了原有食用菌的生理调节功效，并且在发酵过程中这种大型的真菌分解出的酶可以促进许多新的风味物质的形成[7～9]。因此，开发新型发酵型食用菌功能饮料具有广阔的前景。

本文选用灵芝为出发菌株，以具有抗氧化性功效的中草药陈皮及口感较好的雪梨为培养基，添加柠檬酸及低糖的木糖醇进行混合发酵灵芝，对所得的复合型饮料以感官评价为评价指标进行优化，并进一步对该复合饮料的活性物质及抗氧化性进行分析，为研究发酵型饮料提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

灵芝菌种购于山东冠县灵芝基地；陈皮、雪梨市售。木糖醇(食品级)购于河南郑州双腾实业有限公司；柠檬酸(食品级)购于亿岩生物科技股份责任制有限公司；熊果酸、芦丁标准品购于广东广州国家标准物质商城。其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

350G小型超细食品电动磨粉机(浙江万基塑业有限公司)；UV-6100H型紫外可见分光光度计(上海美普达科学分析仪器有限公司)；JJ224BC电子天平(上海花潮高科实验仪器有限公司)；TDZ5WSB低速自动离心机(太原迈达仪器有限公司)；DKZ-2电热恒温振荡水槽(太原迈达仪器有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 复合饮料研制的工艺流程

PDA液体培养基复配雪梨、陈皮、木糖醇、柠檬酸接种灵芝→发酵→粗滤→高温灭菌→冷却成品。

1.3.2 工艺说明

1.3.2.1 陈皮汁制备

称取适量陈皮按料液比1∶30(g·mL-1，质量体积比)配制，沸水浴浸提两次，每次1 h，纱布过滤后冷藏备用。

1.3.2.2 雪梨汁制备

将雪梨清洗干净后进行削皮去核并切块，按料液比1∶2的比例榨汁后，纱布过滤，制成溶液，冷藏备用。

1.3.2.3 发酵

将1.3.2.1中活化的灵芝菌种按接种量为0.1%的接入含有陈皮汁，雪梨汁，木糖醇和柠檬酸的PDA液体培养基中，在28 ℃、150 r·min-1条件下培养7 d，得到的发酵产物多次过滤除杂，经4 ℃、10 000 rpm离心后，取上清，得到最终的复合饮料，120 ℃灭菌 30 min，迅速冷却至室温。

1.3.3 复合饮料的单因素试验试验

1.3.3.1 陈皮雪梨比例

在50 mL PDA液体培养基中分别添加总量为20 mL不同体积比例的陈皮雪梨混合液(陈皮：雪梨为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1)混合均匀，以不添加雪梨、陈皮为对照，在28 ℃，150 r/min的恒温振荡器中培养7 d。其他变量按最小量添加(木糖醇的含量为4 g·100 mL-1，柠檬酸为0.04 g·100 mL-1)观察灵芝菌丝生长情况，各3组平行试验，对发酵的灵芝陈皮雪梨复合饮料进行感官评分。

1.3.3.2 陈皮雪梨添加量

设定陈皮汁与雪梨汁的体积比为1∶3，木糖醇的含量为4 g·100 mL-1，柠檬酸为0.04 g·100 mL-1，陈皮雪梨汁添加量为60%、50%、40%、30%和20%,5个梯度下混合发酵灵芝，各3组平行试验，对发酵的灵芝陈皮雪梨复合饮料进行感官评分。

1.3.3.3 木糖醇添加量

设定陈皮汁与雪梨汁的体积比为1∶3，陈皮雪梨汁添加量为40%，柠檬酸为0.04 g/100 mL分别在木糖醇含量为3、4、5、6、7、8 g·100 mL-1的为5个梯度下混合发酵灵芝，各3组平行试验，对发酵的灵芝陈皮雪梨复合饮料进行感官评分。

1.3.3.4 柠檬酸添加量

设定陈皮汁与雪梨汁的体积比为1∶3，陈皮雪梨汁添加量为40%，木糖醇为4 g/100 mL，分别在柠檬酸含量为0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14 g/100 mL的5个梯度下混合发酵灵芝，各3组平行试验试验，对发酵的灵芝陈皮雪梨复合饮料进行感官评分。

1.3.3.5 响应面法优化复合饮料

以产品感官品分作为评价指标，对复合饮料调配的陈皮雪梨比例、陈皮雪梨添加量、木糖醇添加量、柠檬酸添加量进行响应面分析(表1)，确定最优组合。

表1 Box-Behnken响应面分析试验因素水平表

Table1 Factors and their levels of response surface design

因素Factors编码水平Levels-101A陈皮雪梨比例 Proportion of tangerine peel and pear1∶21∶31∶4B陈皮雪梨添加量 Adding amount of tangerine peel and pear30 %40 %50 %C木糖醇含量/g·100 mL-1The content of xylitol 345D柠檬酸含量/g·100 mL-1The content of citric acid0.100.120.14

1.3.4 复合饮料的评定标准

复合饮料杀菌后，由30名品评员组成感官评价小组(男女各15人)对其进行感官评分，每次评分前用温开水漱口。感官评价参考文献进行[10]，见表2。

1.3.5 理化指标测定

可溶性固形物采用折光法测定[11]；采用精密酸度计对饮料pH 值进行测定。多糖的提取参考文献进行[12]，并绘制标准曲线：y=1.041 4x，R2为0.999 6，R2=0.999 1。总三萜的提取参考文献进行[13]，并绘制标准曲线：y=0.140 8x+0.002 6，R2=0.999 1。

1.3.6 抗氧化性的测定

参照文献进行[14]。其中，灵芝发酵液抗氧化性的测定直接测定发酵原液。

1.3.7 微生物指标检测

参照 GB 7101-2015《食品安全国家标准饮料》方法检验。

1.4 数据统计

数据处理和统计分析采用SPSS 19.0软件进行，均值之间的显著性差异采用Duncan′s Multiple

表2 复合饮料感官评价表Table 2 Criteria for sensory evaluation of compound beverage

Range Test进行检验对进行。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 陈皮雪梨比影响因素

从图1可以看出，不同体积陈皮雪梨比对复合饮料的口感有一定的影响，当陈皮雪梨体积比为1∶3的时候，感官评价得分最高，因此选择陈皮雪梨的最佳比例为1∶3。

2.1.2 陈皮雪梨添加量影响因素

从图2可以看出，随着陈皮雪梨添加量的增加，感官评分也在逐渐增高，当达到40%时，评分最高，在40%以后，随着陈皮雪梨添加量的增加，评分降低，表明复合饮料在此条件下，效果最佳。

2.1.3 木糖醇添加量影响因素

图1 陈皮雪梨体积比对复合饮料感官性状的影响Fig.1 Effect of tangerine peel and pear volume ratio on the sensory score of clarified compound beverage

图2 陈皮雪梨添加量对感官性状的影响Fig.2 Effect of adding amount of tangerine peel and pear on the sensory score of clarified compound beverage

图3 木糖醇添加量对性状评价的影响Fig.3 Effect of adding amount of newtol on the sensory score of clarified compound beverage

从图3可以看出，感官评分随着木糖醇含量的 增加而增高，在4 g/100 mL时，评分最高，当高于或者低于4 g/100 mL时，评分依次降低，木糖醇含量过高或过低，均会影响口感，感官评价均较差。

2.1.4 柠檬酸添加量影响因素

由图4可知，随着木糖醇含量的增加，感官评分也在增高，当柠檬酸添加量为0.12 g/100 mL时感官评分达到最高，表明柠檬酸含量在0.12 g/100 mL时效果最佳，产品酸甜可口，品质较好。

图4 柠檬酸添加量对感官性状的影响Fig.4 Effect of adding amount of citric acid on the sensory score of clarified compound beverage

2.2 响应面优化

通过单因素试验得出，陈皮雪梨比例为1∶3、陈皮雪梨汁添加量为40 %、木糖醇含量为4 g/100 mL、柠檬酸含量为0.12 g/100 mL时效果最佳，以饮料的感官得分为响应值进行响应面的分析试验，如下表3。

对上表的试验数据进行处理，得到以下四元二次方程：

Y=96.667+0.000 A-1.176B-0.667C+1.381D-7.079 A×A-8.592B×B-6.329C×C-4.843D×D-1.000 A×B-0.250 A×C+0.750 A×D-0.750B×C+0.892B×D-0.500C×D

对表3的设计试验的数据进行分析得到响应面回归模型的系数显著性可见4因素3水平方差分析结果由表4可知。

如表5所知，本试验所用的二次模型的极显著性(P<0.01)显著(P<0.05)，可见陈皮雪梨添加量(B)、柠檬酸含量(D)以及A2、B2、C2、D2对感官得分有非常显著的影响P<0.01，木糖醇含量(C)对其也有较显著的影响p<0.05，这些说明试验因素对感官得分的影响不是所谓的线性关系，同时也可以得知研究的几个单因素对感官得分影响的程度依次为：柠檬酸含量>陈皮雪梨添加量>木糖醇含量>陈皮雪梨比例。由表4所显示的分析结果所示，本试验所用方差分析模型显著性P<0.000 1为极显著，而失拟项P=0.260>0.05为不显著，说明模型对实践的拟合程度很好，对现实生活有非常好的指导作用。同时也意味着此所模拟的实践中的四因素三水平是可靠的，可以运用所得到的回归方程对试验数据模拟分析，从而得到开发灵芝陈皮雪梨饮料的最好条件。通过对回归方程的降维分析来探讨任意两个因素是否同时影响复合饮料的口味，结果如图5所示。

表3 陈皮雪梨发酵灵芝复合饮料最佳配方工艺响应面试验设计及结果Table 3 Response surface design arrangement and corresponding experimental data

由图5等高线可以看出柠檬酸含量与陈皮雪梨比例(图5c)、柠檬酸含量与陈皮雪梨添加量(图5e)组合对复合饮料的口味的影响较大。当陈皮雪梨比例和陈皮雪梨添加量一定时，感官得分随着柠檬酸含量的增加呈现先上升后下降的趋势。

2.3 最佳条件的确定以及验证试验分析

通过响应面试验数据分析，得到通过计算得出陈皮雪梨比例为0.38，陈皮雪梨汁添加量为41%，柠檬酸的用量为0.11 g/100 mL，木糖醇的用量为3.94 g/100 mL预期感官得分为96.358 4，在这样的条件下饮料达到最优，但考虑到实际问题将试验条件修改为为陈皮雪梨比例为1∶3，陈皮雪梨汁添加量为60%、50%、40%、30%和20%， 5个梯度下混合发酵灵芝，各3组平行试验，对发 酵的灵芝陈皮雪梨复合饮料进行感官评分。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance for quadric regression model

注：**为极显著：*为显著。

Note:**Extremely striking contrast，*Striking contrast.

注：**为极显著：*为显著。

Note：**Extremely striking contrast，*Striking contrast.

2.4 理化指标检测

经测定，可溶性固形物为含量117.3 mg·mL-1、pH5.25～5.75。在最优组合下，对陈皮雪梨发酵灵芝复合饮料中的活性物质和抗氧化性进行测定后，结果如下(表6、表7)。

加量为40%，柠檬酸的用量0.11 g/100 mL，木糖醇的用量为4 g/100 mL按照此提取条件进行三组平行试验，得到的饮料颜色纯净自然，有清新的陈皮味，并且伴有灵芝特有的味道，酸甜适中，感官得分为96，与理论值96.358 4相对照，相对差值为0.358 4，从而充分证明响应面分析对实践具有非常有效的指导意义。

从表6可以看出，灵芝陈皮发酵灵芝的复合饮料中含有活性物质多糖和总三萜化合物，并且多糖和总三萜的含量高于灵芝发酵液中多糖和三萜的含量。从表7可以看出，该复合饮料具有一定的氧化性，羟自由基清除率为16.27%，还原力为0.23，均高于灵芝发酵原液。

图5 各两因素交互作用对饮料感官评分影响的响应面及等高线图Fig.5 Response surface and contour plots showing the effects of various ingredients on the sensory score of beverage

Table6 Active ingredient of compound beverage under the optimal combination

检测指标Active ingredient mg·mL-1对照(灵芝发酵液)Control (Ganoderma lucidumfermentation broth)复合饮料Compound beverage多糖Polysaccharide137.80±0.08a152.44±0.07b总三萜Total triterpenes83.36±0.0.06a92.09±0.08b

注：数据右上角标注的字母表示不同处理的同一指标在0.05水平上的显著差异性。

Note：Different capital letters show significant difference at the 0.05 level in the same row.

2.5 微生物指标

细菌总数<100 cfu/mL，大肠杆菌< 6 MPN/100 mL，致病菌未检出。

表7最优组合下复合饮料的抗氧化性能

Table7 Anti-oxidative properties of compound beverage under the optimal combination

检测指标Active ingredient 对照(灵芝发酵液)Control (Ganoderma lucidum fermentation broth)复合饮料Compound beverage羟自由基清除率/%13.52%±0.18a16.27%±0.18b还原力 (OD)0.11±0.17a0.23±0.18b

注：数据右上角标注的字母表示不同处理的同一指标在0.05水平上的显著差异性。

Note：Different capital letters show significant difference at the 0.05 level in the same row

3 讨论

本研究优化后得到的陈皮雪梨发酵灵芝的复合饮料具有一定的抗氧化性，且抗氧化性能高于灵芝发酵液中。对复合饮料中的活性物质多糖和总三萜的含量高于灵芝发酵液中的含量，推测引起这种变化的原因，可能是在发酵液中灵芝会吸收陈皮雪梨中的某些营养物质作为合成多糖和某些抗氧化活性物质的原料，其次，灵芝发酵过程中产生的酶会水解陈皮雪梨中细胞壁上的纤维素和木质素等，可引起多糖等物质的释放；除此之外，微生物在发酵过程中的生物转化作用导致其他成分可能转化为多糖类物质。

大分子物质会被灵芝生长过程中产生的酶类水解，有研究表明，灵芝胞外三萜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都具有较好的抑菌作用[15～17]。本研究制备的陈皮雪梨发酵型功能饮料含有较高的三萜类化合物，可以进一步探讨该饮料的抑菌及其他生理调节功能。

4 结论

采用响应面法优化陈皮雪梨发酵灵芝最佳配方，通过模型回归分析得到在试验范围内存在最大值，100 mL发酵复合饮料的最佳配方比为陈皮雪梨汁40%，体积比1∶3，柠檬酸0.11 g，木糖醇4 g。该复合饮料中的多糖含量为152.44 mg·mL-1，总三萜含量为92.09 mg·mL-1，与灵芝发酵原液相比，羟自由基清除率为16.27%，还原力为0.23，具有一定的抗氧化性。