固定组织的冰冻切片技术探讨

2018-09-05黄小雨仲欢欢付琳琳董红燕董富兴

山西医科大学学报 2018年8期

黄小雨,仲欢欢,付琳琳,董红燕,董富兴*

(1徐州医科大学形态学科研实验中心,徐州 221004;2徐州医科大学病原生物学与免疫学教研室;*通讯作者,E-mail:fxdongxzmc@163.com)

冰冻切片是一种借助低温环境,使组织在短时间内达到一定硬度而进行切片的方法。由于冰冻切片比石蜡切片相对省时且能较好地保护抗原活性,因此广泛地应用于临床病理快速诊断和科学研究[1]。在科学研究中,特别是在进行免疫组化和免疫荧光染色实验前,需要将动物进行灌注固定,实验人员尤其是刚入门的新手在制作冰冻切片过程中经常出现切片不完整、刀痕、冰晶、皱折等问题,制片难度相对较大。要制作出高质量切片,实验人员除了熟练掌握切片方法,还需要注意实验过程中的每一个细节。作者通过不断实践和积极探索,就冰冻切片各个环节中出现的常见问题及操作技巧介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料

恒温式冰冻切片机(德国Leica,CM1950),BTl00-02型蠕动泵(保定齐力恒流泵有限公司),正置显微镜(日本Olympus,BX41);10%水合氯醛,4%多聚甲醛(0.1 mol/L PB溶液配置),生理盐水,15%和30%蔗糖溶液(0.1 mol/L PB溶液配置),OCT包埋剂(美国Sakura公司)。

1.2 方法

1.2.1 灌注固定取小鼠称重,用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g体质量)腹腔膜注射麻醉后固定于解剖手术台,分离皮下组织,充分暴露胸腔,将灌注针(7#)插入左心室并送至升主动脉内,同时剪开右心耳,用蠕动泵依次灌注生理盐水和4%多聚甲醛,其中前1/3量快速灌注(70 r/min),后2/3量缓慢灌注(50 r/min)。灌注结束后取心、肝、肾、脾、肺、脑6种组织,分别浸泡于4%多聚甲醛中,4 ℃后固定过夜后依次浸入15%和30%蔗糖溶液直至沉底。

1.2.2 冰冻切片将组织从30%蔗糖溶液中取出,用滤纸吸去多余液体后,用OCT将组织包埋于铝箔纸做成的圆柱体状容器中,然后在-80 ℃冰箱中冷冻30 min,之后快速取出放于冰冻切片机箱体中复温30 min后进行常规切片,切片厚度为10 μm,贴于黏附载玻片上,自然风干后进行下一步染色。

1.2.3 HE染色将切片复水后置于苏木素染液10 min,水洗2 min,用1%盐酸乙醇分化15 s,水洗2 min,自来水返蓝20 min,伊红2 min,水洗1 min,90%乙醇30 s,95%乙醇5 min,100%乙醇5 min,二甲苯透明后中性树胶封固,显微镜下观察拍照。

2 结果

用以上方法对不同组织进行快速冰冻切片,结果显示此方法切片完整、厚薄均匀、贴片平整、不易产生皱折及冰晶,镜下组织结构清晰无皱褶,染色清晰,核浆对比度好,色彩鲜艳(见图1)。

A.肝;B.脾;C.肺;D.肾;E.心;F.脑皮质图1 不同组织的冰冻切片HE染色结果 (×40)

3 讨论

冰冻切片制作过程相比石蜡切片更加便捷,因其能较好地保存抗原活性和组织结构,所以广泛应用在科研和临床病理诊断中。对于科研工作者,尤其是刚入门的“新手”,熟练掌握冰冻切片技术且制作出高标准的切片并非易事,冰冻切片的质量受多方面因素的影响,我们实验室经过长期实践主要从以下环节上加强质控。

3.1 灌注固定

良好的组织固定是防止组织细胞自溶与腐败,保存细胞内蛋白质、脂肪、糖等各种成分的关键。本实验采用蠕动泵进行灌注固定,它模拟了动物心跳动,固定效果好,染色效果佳且可操控性强[2]。灌注固定时操作要干脆利落,从开胸到进针的整个过程,时间尽量控制在3 min内,否则容易引起部分组织如肾、肺等出现凝血现象以及肝脏、脑等器官组织自溶。插灌注针时,未经处理的输液管针头过于锋利易刺入右心房,操作过程中也会出现针头滑脱问题。为了避免这些现象,我们将针头剪除针尖,进针时动作轻慢有突破感即止,针头方向略偏左侧,通过这些改进使灌注成功率显著上升。陈浩宇等[3]设计出一种特殊针头,可有效防止针头滑脱,但大量实践发现针头滑脱多由于实际操作过程中碰到输液管引起,正常灌注压力下针头并不会滑脱,实验中我们通过捋顺输液管且尽量不触碰它发现滑脱现象很少发生。在剪开右心耳时,开口要大一些,否则灌注液进的多出的少极易引起动物组织水肿,影响实验结果的判断。灌注时通常先快速用生理盐水冲干净血液避免红细胞在后期的染色过程中造成非特异性染色,然后以先快后慢的方式用4%多聚甲醛灌注固定组织,这种方法可以提高组织固定效果[4]。此外,在灌注下一只动物时要及时排空灌注管中残留的多聚甲醛,灌注管中也不应有气泡,否则会造成空气栓塞,以致影响局部组织的灌注效果。

3.2 准备工作

想要高效率地切出一张完整的切片,准备工作尤为重要。冰冻切片机应处于24 h恒温待机状态,切片前1 h,先将机器设定到切片所需的温度,冷冻室温度和样品头温度可调整到-22 ℃左右,否则温度过高切片容易皱折,过低则会出现组织碎裂。防卷板完整对于切出一张完整的切片至关重要,可以节省大量的时间。正常防卷板与切片刀角度为5°左右,防卷板的前缘与刀面有足够的距离且略高于刀刃的最高点,以使切出的切片能顺利通过刀与防卷板间的缝隙为宜[5]。

3.3 包埋

待组织在30%蔗糖溶液中沉底后,将其取出,并用滤纸吸去多余液体。利用高渗蔗糖溶液吸收组织中水分,减少组织含水量,降低冰冻切片时组织中冰晶的产生,防止组织出现冰晶空洞导致细胞形态发生改变。组织块不宜过厚过大,一般应小于1 cm3,这样有利于组织的速冻,组织过大切片时容易出现褶皱。本实验将铝箔纸制作成圆柱状类似于包埋盒包埋组织,组织经过OCT包埋后立即置入-80 ℃低温冰箱,使其迅速跨越冰晶形成的临界温度,显著减少了冰晶的的产生且较好地保存组织的完整性,切片时组织周围OCT胶形状相对规则,切片不容易出现皱折[6]。此外,还要注意一定要确保样品托底部干燥,否则在速冻时容易粘在冷冻台上。

3.4 冷冻温度

温度的调节对于冰冻切片是非常重要的,应根据组织的种类和大小对温度进行调节。对于样品头温度,王秀萍[5]等认为:细胞致密且较硬的组织温度控制在(-16)-(-20)℃;细胞疏松且较软的组织温度控制在(-20)-(-22)℃;脂肪组织温度控制在(-22)-(-24)℃。我们对小鼠不同组织进行冰冻切片的实际操作中,切片机(Leica CM1950)的工作室温度设置在(-20)-(-23)℃,脑组织等含水量较大的样品头温度设置在(-18)-(-20)℃,肝、肾、脾等实质性器官组织温度设置在(-19)-(-22)℃,心、肺等空腔器官为(-20)-(-23)℃。在这样一个温度范围内切出来的切片比较完整,但是鉴于不同品牌的切片机的性能不尽相同,本文结果仅供同型号切片机参考。