五种生防芽孢杆菌碳源代谢表型分析

张之矾，王开宇，孟 源，刘明竞，汪汉成



五种生防芽孢杆菌碳源代谢表型分析

张之矾1，王开宇1，孟 源1，刘明竞1，汪汉成2*

（1.贵州省烟草公司遵义市公司正安县分公司，贵州 正安 563400；2.贵州省烟草科学研究院，贵阳 550081）

为了解芽孢杆菌类生防细菌的碳源代谢表型特征，以5种7株生防芽孢杆菌[短小芽孢杆菌（）、地衣芽孢杆菌（）、解淀粉芽孢杆菌（）、饲料类芽孢杆菌（）及枯草芽孢杆菌（）]为对象，采用Biolog代谢表型技术测定了它们的190种碳源代谢表型。结果表明，碳源代谢数量最多的是短小芽孢杆菌，为107种，其他依次为：地衣芽孢杆菌（96种）、解淀粉芽孢杆菌（89种）、饲料类芽孢杆菌菌株4（75种），菌株5（78种）、枯草芽孢杆菌菌株1（74种）、菌株2（70种）。芽孢杆菌菌株在种间和种内的代谢表型间均存在差异，共同代谢的碳源有54种，其中高效代谢的碳源有24种，包括17种多糖类碳源（L-阿拉伯糖、D-海藻糖、D-甘露醇、甘油、D-木糖、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖等）和7种有机酸类碳源（D,L-苹果酸、L-天冬酰胺酸、柠檬酸、延胡索酸、L-苹果酸、丙酮酸和5-酮基-D-葡萄糖酸）。研究结果为芽孢杆菌类生防菌剂的开发和利用提供了理论基础。

生防芽孢杆菌；碳源；代谢表型

芽孢杆菌（）是植物病害生物防治中一类重要的微生物，其种类多、分布广，是土壤和植物生态环境中的优势细菌[1-2]。它们大部分呈革兰氏阳性，G+C含量低、过氧化氢酶阳性、好氧、杆状，具备运动能力。这类细菌通过分泌抗生素类物质、生态位竞争及诱导植物产生抗性等多种途径来防治植物病害[3-7]。它们具有广泛的抗细菌、真菌、病毒和支原体的能力，因而成为生物农药和功能性生物有机肥研发的重要微生物资源。目前，我国农业部门正在大力推广药肥双减、增施有机肥的农作物耕作制度，烟草上也正在广泛实施病虫害的绿色防控。为此，稳定、高效的微生物生防菌剂正在被大力开发与推广应用。报道较多的有枯草芽孢杆菌（）、解淀粉芽孢杆菌（）、饲料类芽孢杆菌（）、地衣芽孢杆菌（）、短小芽孢杆菌（）等[8-15]。

芽孢杆菌通常在实验室表现出较好的抑菌效果，而在田间应用中常常防效不稳定，在不同的温度、气候、土壤等环境下的防治效果间也存在着差异。影响芽孢杆菌环境适应性和功能发挥的因素有很多，其中营养元素中的碳源尤为重要。它与芽孢杆菌的生存、定殖、芽孢的形成与萌发、次生代谢产物的产生、对植物抗性的诱导等密切相关[16-18]。了解芽孢杆菌的碳源代谢特征对其生防菌剂和次生代谢产物的开发均具有重要的意义。传统的碳源代谢信息的获得主要基于室内生理生化反应试验，需要花费大量的时间和精力，获得的信息十分有限，且容易出现错误，不能动态反应其生长需求和代谢信息。因此，亟待采用新的技术手段对芽孢杆菌类细菌的碳源代谢特征进行快速分析。Biolog微生物代谢表型科技可以快速、高效、准确地进行芽孢杆菌碳源代谢特征分析[19-20]。本研究以前期获得的生防芽孢杆菌为对象，采用Biolog代谢表型技术对试验细菌的碳源代谢表型进行分析，并对不同种芽孢杆菌的碳源代谢特征进行比较，旨在为芽孢杆菌类生防菌剂的开发和利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 枯草芽孢杆菌（）菌株1和2、解淀粉芽孢杆菌（）菌株3、饲料类芽孢杆菌（）菌株4和5、地衣芽孢杆菌（）菌株6和短小芽孢杆菌（）菌株7，均由贵州省烟草科学研究院微生物实验室前期通过Biolog微生物鉴定获得。

1.1.2 供试培养基与试剂 细菌培养使用牛肉膏蛋白胨固体（NA）和液体培养基（NB）[21]及（BUG+B）培养基。BUG琼脂、PM 1-2代谢板、接种液IF-0a GN/GP（#72268）和IF-10b GN/GP（#72266）及染料Mix F（#74226）、Mix G（#74227）和Mix H （#74228），均购自美国Biolog公司。PM 1-2代谢板中被测试的碳源信息详见文献[19]。冻干脱纤维羊血（B）购自北京友康基业生物科技有限公司。

1.2 芽孢杆菌的碳源代谢表型分析

参照Biolog革兰氏阳性细菌代谢表型分析的标准程序[19]，测定各芽孢杆菌的代谢表型。将各细菌分别在（BUG+B）平板上活化，按照要求配制PM 1-2的接种液和各细菌新鲜细胞悬浮液，将悬浮液浓度调至81%T（T为Biolog标准浓度单位）。将1.76 mL细胞悬浮液添加至22.24 mL的PM 1和PM 2接种液中，混合均匀，用8通道电动移液器将混匀后的细胞悬浮液添加至PM 1和PM 2代谢板中，每孔100 µL。将接菌后的代谢板置于OmniLog恒温培养箱中，30 ℃培养48 h，设置OmniLog工作软件，采用Biolog D5E_OKA_data.exe软件收集各芽孢杆菌的碳代谢表型数据。根据各细菌代谢的动力学曲线，分析其碳源代谢表型。

1.3 芽孢杆菌碳代谢表型的比较

采用Biolog OL_FM_1.2.exe软件将各芽孢杆菌的碳代谢表型数据进行转换。采用Biolog OL_PR_1.2.exe软件将转换后数据进行比对分析，选择峰面积（Area）为对比参数，峰面积越大，说明测试细菌对被检测碳源的代谢越强。根据峰面积的大小来比较各芽孢杆菌代谢表型的差异。

2 结 果

代谢表型分析检测了各芽孢杆菌190种（PM 1和PM 2板的A1孔均为阴性对照，碳源种类共计190种）碳源的代谢表型信息。结果如表1-2所示，7株芽孢杆菌的碳源代谢数量间存在差异。代谢数量最多的为短小芽孢杆菌（）菌株7，其代谢碳源数量为107种；其次为地衣芽孢杆菌（）菌株6（96种）和解淀粉芽孢杆菌（）菌株3（89种）；饲料类芽孢杆菌（）菌株4和5代谢的数量分别为75种和78种；代谢数量最少的为枯草芽孢杆菌（）菌株1（74种）和2（70种）。

7株芽孢杆菌均能代谢的碳源有54种，包括：L-阿拉伯糖、N-乙酰葡糖胺、L-脯氨酸、D-海藻糖、D-甘露醇、D-山梨醇、甘油、D-葡萄糖酸、D-木糖、L-乳酸、D-甘露醇、L-谷氨酸、D,L-苹果酸、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖、麦芽糖、胸苷、L-天冬酰胺酸、蔗糖、L-谷氨酰胺、6-磷酸果糖、ß-甲基-D-葡萄糖苷、麦芽三糖、腺苷、柠檬酸、M-肌糖、延胡索酸、D-纤维二塘、肌苷、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-苹果酸、D-阿洛酮糖、L-来苏糖、丙酮酸、糊精、胶质、D-阿拉伯糖、熊果苷、2-脱氧-D-核糖、麦芽糖醇、α-甲基-D-葡萄糖苷、异麦芽酮糖、D-棉子糖、水杨苷、D-塔格糖、松二糖、D-氨基葡萄糖、5-酮基-D-葡萄糖酸、山梨酸、L-鸟氨酸和二羟基丙酮；其中高效代谢的有23种，包括16种多糖和7种有机酸：L-阿拉伯糖、D-海藻糖、D-甘露醇、甘油、D-木糖、D,L-苹果酸、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖、L-天冬酰胺酸、蔗糖、柠檬酸、延胡索酸、D-纤维二塘、L-苹果酸、丙酮酸、D-塔格糖、熊果苷、2-脱氧-D-核糖、异麦芽酮糖、D-氨基葡萄糖、5-酮基-D-葡萄糖酸和二羟基丙酮（表1、2）。

除上述共有碳源外，短小芽孢杆菌菌株7代谢的优势碳源还包括：琥珀酸(PM 1 A5)、D-半乳糖(PM 1 A6)、L-天冬氨酸(PM 1 A7)、D-丙氨酸(PM 1 A9)、D-葡糖醛酸(PM 1 B5)、D,L-α-磷酸甘油(PM 1 B7)、L-鼠李糖(PM 1 C6)、D-蜜二糖(PM 1 C11)、D-天门冬胺酸(PM 1 D2)、尿苷(PM 1 D12)、M-酒石酸(PM 1 E2)、2-脱氧腺苷(PM 1 E11)、溴丁二酸(PM 1 F6)、甘氨酰-L-谷氨酸(PM 1 G1)、L-苏氨酸(PM 1 G4)、甘氨酰-L-脯氨酸(PM 1 H1)、凝胶(PM 2 A7)、肝糖(PM 2 A8)、菊糖(PM 2 A9)、海带多糖(PM 2 A10)、杏苷(PM 2 B4)、3-0-ß-D半乳糖-D-吡喃糖(PM 2 B12)、龙胆二糖(PM 2 C1)、ß-甲基-D-半乳糖苷(PM 2 C7)、α-甲基-D-甘露糖苷(PM 2 C10)、L-山梨糖(PM 2 D4)、水苏糖(PM 2 D5)、γ-氨基丁酸(PM 2 D10)、奎尼酸(PM 2 F6)、L-精氨酸(PM 2 G4)、D,L-章鱼胺(PM 2 H7)和2,3-丁二醇(PM 2 H10) （表1、2）。

除上述共有碳源外，地衣芽孢杆菌菌株6代谢的优势碳源还包括：琥珀酸(PM 1 A5)、D-半乳糖(PM 1 A6)、L-天冬氨酸(PM 1 A7)、D-丙氨酸(PM 1 A9)、D-葡糖醛酸(PM 1 B5)、L-鼠李糖(PM 1 C6)、D-蜜二糖(PM 1 C11)、D-天门冬胺酸(PM 1 D2)、溴丁二酸(PM 1 F6)、丙酮酸甲酯(PM 1 G10)、凝胶(PM 2 A7)、肝糖(PM 2 A8)、菊糖(PM 2 A9)、杏苷(PM 2 B4)、龙胆二糖(PM 2 C1)、α-甲基-D-甘露糖苷(PM 2 C10)、γ-氨基丁酸(PM 2 D10)、奎尼酸(PM 2 F6)和L-精氨酸(PM 2 G4) （表1、2）。

除上述共有碳源外，解淀粉芽孢杆菌菌株3代谢的优势碳源还包括：琥珀酸(PM 1 A5)、D-半乳糖(PM 1 A6)、L-天冬氨酸(PM 1 A7)、D-丙氨酸(PM 1 A9)、α-D-乳糖(PM 1 D9)、尿苷(PM 1 D12)、乙酰乙酸(PM 1 G7)、半乳糖醛酸(PM 1 H10)、肝糖(PM 2 A8)、杏苷(PM 2 B4)、3-0-ß-D-半乳糖-D-吡喃糖(PM 2 B12)、龙胆二糖(PM 2 C1)（表1、2）。

同为饲料类芽孢杆菌，菌株5代谢的碳源数量略多于菌株4，除上述共有碳源外，饲料类芽孢杆菌菌株4代谢的优势碳源还包括：L-天冬氨酸(PM 1 A7)、杏苷(PM 2 B4)、龙胆二糖(PM 2 C1)和精氨酸(PM 2 G4)；菌株5代谢的优势碳源还包括：3-0-ß-D半乳糖-D-吡喃糖(PM 2 B12)和龙胆二糖(PM 2 C1) （表1、2）。

同为枯草芽孢杆菌，菌株1代谢的碳源数量多于菌株2，除上述共有碳源外，菌株1代谢的优势碳源还包括：D-半乳糖(PM 1 A6)、L-天冬氨酸(PM 1 A7)、D-丙氨酸(PM 1 A9)、α-D-乳糖(PM 1 D9)、尿苷(PM 1 D12)、3-0-ß-D半乳糖-D-吡喃糖(PM 2 B12)和龙胆二糖(PM 2 C1)；菌株2代谢的优势碳源还包括：D-糖二酸(PM 1 A4)、丙酮酸甲酯(PM 1 G10)和D-半乳糖醛酸(PM 1 H10)（表1、2）。

表1 7株芽孢杆菌在Biolog PM 1板上的碳源代谢特征

注：“−”、“+”及“++”分别表示Biolog PM 1板中的碳源能够被各芽孢杆菌不代谢、代谢及高效代谢。A1-H12 代表Biolog PM 1微孔板被测试的碳源。

Note: “−”, “+” and “++” means that the tested bacteria could not utilize the tested carbon substrate, utilized moderately and effectively, respectively. A1 to H12 means the carbon substrates tested in Biolog PM 1 microplate.

表2 7株芽孢杆菌在Biolog PM 2板上的碳源代谢特征

注：“−”、“+”、及“++”分别表示Biolog PM 2板中的碳源能够被各芽孢杆菌不代谢、代谢及高效代谢。A1−H12 代表Biolog PM 2微孔板被测试的碳源。

Note: “−”, “+” and “++” means that the tested bacteria could not utilize the tested carbon substrate, utilized moderately and effectively, respectively. A1 to H12 means the carbon substrates tested in Biolog PM 2 microplate.

3 讨论与结论

目前，烟草病害防治登记的药剂仍以化学药剂为主，随着绿色生态防控技术的发展与完善，生物农药正被用于多种病害的防治。枯草芽孢杆菌被登记用于防治烟草黑胫病、赤星病及野火病等，用于青枯病防治的菌株则有解淀粉芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌及荧光假单胞菌。尽管生防菌剂的防效有限，但随着对产品安全性的重视，芽孢杆菌类的生防菌剂仍具有广阔的前景。芽孢杆菌的研究涉及到各个领域，包括感受态、芽孢形成及其调控、遗传操作、菌种改良、定殖规律、生物技术、基因组学、次生代谢产物等[22-25]。本研究通过微生物代谢表型分析测定了5种7株芽孢杆菌的190种碳源代谢表型，研究结果进一步丰富了芽孢杆菌的研究内涵。

碳源是微生物生长所需的一类营养物质，是含碳化合物，主要包括糖类、油脂、有机酸、有机酸酯和小分子醇。它为微生物的生长代谢提供细胞碳架，提供生命活动所需的能量，同时也提供其代谢产物的碳架[26-28]。碳源通常是制作微生物培养基或细胞培养基时必需的物质，为微生物或细胞的正常生长、分裂提供物质基础。微生物由于产生酶系的不同，因而具有代谢不同碳源的能力。本研究中5种芽孢杆菌均能代谢的碳源为糖类和少量的有机酸；其中高效代谢的碳源以多糖为主，涉及糖酵解过程中的柠檬酸、延胡索酸、L-苹果酸、丙酮酸等也能被高效代谢。研究结果表明糖类是芽孢杆菌赖以生存的基本物质，部分有机酸对其生命活动也具有重要的意义。长期以来，芽孢杆菌是生物农药、生物肥料、生物饲料等微生物菌剂开发的重要资源；然而，诸多微生物菌剂的开发与应用仍存在技术障碍。本文获得的芽孢杆菌高效代谢的特征性碳源对克服碳源营养障碍具有参考意义。

本文获得了5种芽孢杆菌共有的碳源代谢特征，说明它们具有共同的酶系活性。此外，5种芽孢杆菌碳源代谢能力间存在显著差异，短小芽孢杆菌代谢数量最多，其次为地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，饲料类芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的数量相对较少。代谢数量的差异可能与种间的差异有关，短小芽孢杆菌在代谢有机酸类碳源上更具有优势。这种差异是否与芽孢杆菌属种间的遗传距离有关还值得进一步深入研究。此外，同为饲料类芽孢杆菌（菌株4和5）和枯草芽孢杆菌（菌株1和2），菌株间的碳源代谢特征也不完全相同；但本文结果显示种内间的差异较种间差异小。在后续研究中，有必要增加芽孢杆菌种类的数量和菌株的数量来获得这类细菌更具有代表性的碳源代谢表型信息。

通过碳源代谢表型分析获得了5种芽孢杆菌喜爱的碳源信息，同时也获得了不利于其代谢的碳源信息。利用这些信息可以优化芽孢杆菌的培养条件、优化孢子形成或者萌发的条件、发现导致或抑制细胞分化的条件，以便最大程度地发挥这些细菌的功能和作用，使其应用于多种病害的生物防治、生物菌剂的开发，同时也可以为优化抗生素的工业化生产条件提供理论支持[29-30]。本文所获得的芽孢杆菌碳源代谢表型信息是基于Biolog表型测定平台。然而，这些细菌对相关底物的实际代谢和利用情况是否与表型测定结果一致、相关底物浓度和代谢能力间的关系、如何验证相关底物对芽孢杆菌代谢的影响、相关底物对其孢子形成及次生代谢产物形成的影响、如何将相关底物用于生物菌剂的开发等诸多问题有待继续开展研究。除此之外，芽孢杆菌菌种间的氮源、磷源、硫源等代谢表型特征，及其环境压力下的代谢表型特征，也有待深入地进行比较分析。

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Phenotypic Characterization of Carbon Source Metabolism in Five BiocontrolSpecies

ZHANG Zhifan1, WANG Kaiyu1, MENG Yuan1, LIU Mingjing1, WANG Hancheng2*

(1. Zhengʼan Filiale of Zunyi Tobacco Company, Zhengʼan, Guizhou 563400, China; 2. Guizhou Academy of Tobacco Science, Guiyang 550081, China)

In order to understand carbon source metabolism of the biocontrol bacteria agent, seven strains in five species of(,,,and) were chosen for Biolog metabolic phenotypic analysis. The results indicated that the highest number of carbon metabolized by bacteria was found in, which had 107 different carbon sources; followed by(96 carbon sources),(89 carbon sources),(75 carbon sources for isolate 4 and 78 for isolate 5, respectively), and(74 carbon sources for isolate 1 and 70 for isolate 2, respectively). The metabolic phenotypic characteristics ofamong the strains and the species were different. There were 54 common carbon sources metabolized by all the tested bacteria, among which twenty four were effectively metabolized, including 17 polysaccharose (such as L-arabinose, D-trehalose, D-mannitol, glycerol, D-xylose, D-ribose, D-fructose, D-glucose, sucrose, etc.) and 7 organic acids (D,L-malic acid, L-asparagine, citric acid, fumaric acid, L-malic acid, pyruvate and 5-ketone-D-glucose acid). These findings provide scientific evidence to further developas potential bio-control agents and their actual use in the future.

; carbon sources; metabolic phenotype

S435.72

1007-5119（2018）04-0064-07

10.13496/j.issn.1007-5119.2018.04.009

贵州省科技厅优秀青年人才培养计划{黔科合平台人才[2017]5619}；中国烟草总公司贵州省公司科技项目“‘互联网+烟草植保’的研究与应用”（2017-14）

张之矾（1988-），男，硕士研究生，从事烟草生产技术推广工作。E-mail：307153855@qq.com。

，E-mail：xiaobaiyang126@hotmail.com

2018-04-03

2018-06-14