羟考酮与吗啡在大鼠内脏痛镇痛效应的差异

郭伟兵，李文君，段 姣，陈春龙，胡玉萍，刘清珍，张利东，李伟彦

0 引 言

疼痛是现代人类健康和社会发展的主要问题之一，困扰全球数以亿计的人群。阿片类药物在治疗诸多形式的疼痛过程中应用广泛。但在肌肉和内脏引起的深部痛的治疗过程中发现吗啡并不能提供充分的镇痛效应，而且μ受体的中枢神经系统作用会产生很多副作用，如欣快感、呼吸抑制以及恶心等[1]。而羟考酮是一种μ、κ阿片受体激动剂，与单纯μ受体激动剂吗啡的药理效应不同。临床上也观察到羟考酮在治疗疼痛中比吗啡可能具有更强的镇痛效应，有文献[2]报道，羟考酮与吗啡的镇痛效应在不同组织也不一致，在皮肤和肌肉部位的疼痛，镇痛效应是等效的，而对在食道部位的热和机械刺激引起的疼痛，羟考酮则比吗啡具有更强的镇痛效果，可能与κ阿片受体有关。而羟考酮在对内脏痛的镇痛效应中，κ、μ阿片受体各自的占比仍不清楚。因此本文拟探讨羟考酮与吗啡在内脏痛及炎性痛疼痛模型中的镇痛效应差异，研究羟考酮在不同疼痛模型的镇痛效应差异中与κ受体的结合能力的关系，并初步探讨羟考酮对内脏痛发挥镇痛效应中的κ、μ阿片受体各自占比。

1 材料与方法

1.1药品和试剂盐酸羟考酮注射液(oxycodone，Oxy)由Hamol Limited有限公司生产；盐酸吗啡注射液(morphine,Mor)由东北制药集团沈阳第一制药有限公司生产；冰醋酸溶液由成都市新都区化工试剂厂生产；甲醛注射液由西陇科学股份有限公司生产；选择性μ受体拮抗剂naloxonazine购于Sigma公司；选择性κ受体拮抗剂nor-binhorphimine(Nor-BIN)购于Abcam公司。这6种药物均用等渗盐水溶解或稀释，等渗盐水由石家庄四药有限公司生产。

1.2动物雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠360只，体重200～250 g,清洁级，由南京军区总医院比较医学科提供,实验动物生产许可证号：scxk(军)2012-0014；使用许可证号:syxk(军)2012-0047。实验室光照时间6：00-18：00，温度控制在18～22 ℃，在安静环境中进行行为学观察。为减少生物节律对动物行为的影响，实验时间为每日9：00-12：00，实验前动物不禁饮食。

1.3实验方法SD大鼠360只，在实验开始前均先放入观察箱中适应30 min。观察者、指标统计者均不知相应分组情况。

1.3.12%醋酸扭体模型其中156只SD大鼠以腹腔注射化学物质引起的大鼠扭体反应作为内脏痛的实验模型。随机均分为13组，分别为内脏痛对照组，羟考酮(0.4、0.64、1.0、1.6、2.6、4.2 mg/kg)组；吗啡(0.4、0.64、1.0、1.6、2.6、4.2 mg/kg)组。上述药物均用生理盐水进行配置，分别将上述药液经右侧腹壁注入腹腔，其中对照组注射等量等渗盐水。注药后15 min，将等渗盐水稀释的2%冰醋酸以4 mL/kg经另一侧腹壁注入腹腔，然后立即放入观察箱中观察(开始计时)，以腹部内凹伴后肢伸展计为扭体1次，计数每5 min内出现的扭体次数，作为内脏痛程度的定量指标，计算60 min内扭体总数，并根据各组扭体平均次数计算扭体反应的抑制率。根据扭体抑制率分别计算羟考酮及吗啡在2%醋酸扭体模型中的半数有效量(50% effective dose, ED50)。扭体反应的抑制率计算公式如下：

扭体反应的抑制率=(对照组平均扭体次数-试验组平均扭体次数)/对照组平均扭体次数×100%

1.3.25%甲醛炎性痛模型将180只SD大鼠以左足底注射5%甲醛作为炎性痛模型，随机分为15组，分别为炎性痛对照组，羟考酮(0.6、0.96、1.54、2.46、3.9、6.3、10.0 mg/kg)组；吗啡(0.6、0.96、1.54、2.46、3.9、6.3、10.0 mg/kg)组。甲醛实验在30 cm×30 cm×30 cm有机玻璃笼中进行，分别将上述药液经右侧腹壁注入腹腔，其中对照组注射等量等渗盐水。注药后15 min，参照Zhang等[3]方法，使用30G注射器于大鼠左后爪掌侧皮下注射5%甲醛50 uL后立即放入观察箱中,箱下放置与地面成45°角的镜子以便观察。注射后1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 min进行甲醛疼痛评分[4]：0分为注射爪可正常承重并自由活动，1分为注射爪可接触地面但不能承重，2分为注射爪不能接触地面,3分为大鼠舔咬注射爪。本研究根据权重评分法[4]计算每个观察时间点的甲醛疼痛评分(PIR)作为炎性痛程度的定量指标。PIR=(1*T1+2*T2+3*T3)/60，T1、T2、T3分别为出现评分为1、2、3分行为学表现的持续时间。其中以0～5 min为Ⅰ相，15～60 min为Ⅱ相[4]。根据Ⅰ相、Ⅱ相中甲醛疼痛评分，分别计算Ⅰ相、Ⅱ相的甲醛疼痛抑制率。根据甲醛疼痛抑制率分别计算羟考酮及吗啡在5%甲醛炎性痛模型中的ED50。甲醛疼痛抑制率计算公式如下：

甲醛疼痛抑制率=(对照组平均甲醛疼痛评分-试验组平均甲醛疼痛评分)/对照组平均甲醛疼痛评分×100%

1.3.3羟考酮在内脏痛模型的镇痛效应中κ、μ受体的比例测定根据羟考酮在2%醋酸扭体模型中所测出的ED50值，将24只SD大鼠随机均分为4组，继续使用2%醋酸扭体模型，分对照组(D组)、羟考酮ED50组(E组)、κ受体拮抗剂Nor-BNI 20 mg/kg+羟考酮ED50组(K组)、μ受体拮抗剂naloxonazlne 20 mg/kg+羟考酮ED50组(U组)，计算扭体次数及扭体抑制率。将上述各组药液经右侧腹壁注入腹腔，其中D组注射等量等渗盐水。注药后15 min，将等渗盐水稀释的2%冰醋酸以4 mL/kg经另一侧腹壁注入腹腔，然后立即放入观察箱中观察(开始计时)，观察扭体次数。其中κ受体拮抗剂Nor-BNI、μ受体拮抗剂naloxonazlne的剂量均通过预实验得出继续增加剂量后扭体次数不再增加，从而确定为最佳给药剂量，分别得出给药剂量为Nor-BNI 20 mg/kg，naloxonazine 20 mg/kg,于试验前24 h经皮下给药[5]。得出羟考酮在2%醋酸扭体模型发挥镇痛效应的κ、μ受体所占的比例。

2 结 果

2.1腹腔注射羟考酮与吗啡在2%醋酸扭体模型中的镇痛效应与对照组相比，腹腔注射各浓度吗啡及羟考酮组60 min内扭体次数减少，差异有统计学意义(P<0.05)。羟考酮ED50为0.6602 mg/kg(95%CI=0.02712～16.07 mg/kg)、吗啡为1.942 mg/kg(95%CI=0.2773～13.60 mg/kg)，羟考酮ED50/吗啡ED50约为1∶2.94。见图1。

2.2羟考酮与吗啡在5%甲醛炎性痛模型中的ED50与对照组比较，Ⅰ相及Ⅱ相中腹腔注射各浓度吗啡组及羟考酮组在60 min内舔足抬腿评分减少，差异有统计学意义(P<0.05)。其中Ⅰ相中羟考酮ED50为1.921 mg/kg(95%CI：1.199～3.077 mg/kg)、吗啡ED50为4.484 mg/kg(95%CI：1.797～11.19 mg/kg)，羟考酮ED50/吗啡ED50比值约为1∶2.334；Ⅱ相羟考酮ED50为2.262 mg/kg(95%CI=1.378～3.715 mg/kg)、吗啡ED50为3.812 mg/kg(95%CI：1.769～8.213 mg/kg)，羟考酮ED50/吗啡ED50比值约为1∶1.69。见图2、图3。

2.3羟考酮在2%醋酸扭体模型中κ、μ受体的镇痛效应D组在2%醋酸扭体模型中的扭体次数为(45.8±2.5)次，E组为(22.5±2.4)次，K组为(37.8±1.7)次, U组为(26.8±2.1)次。与D组比较，各组扭体次数减少(P<0.05)。在2%醋酸扭体内脏痛模型中，羟考酮发挥镇痛作用的κ受体与μ受体的比例约为2.375∶1。

a:吗啡的剂量-效应曲线；b：羟考酮的剂量-效应曲线；c:吗啡的log(剂量)-效应曲线；d:羟考酮的log(剂量)-效应曲线与对照组相比，*P<0.05，n=12图1 羟考酮及吗啡在2%醋酸扭体模型中的镇痛效应曲线

a：吗啡的剂量效应曲线；b：羟考酮的剂量效应曲线；c：吗啡的log(剂量)-效应曲线；d：羟考酮的log(剂量)-效应曲线与对照组相比，*P<0.05,n=12图2 羟考酮与吗啡在5%甲醛炎性痛模型I相中的镇痛效应曲线

a：吗啡的剂量效应曲线；b：羟考酮的剂量效应曲线；c：吗啡的log(剂量)-效应曲线；d：羟考酮的log(剂量)-效应曲线与对照组相比，*P<0.05,n=12图3 羟考酮与吗啡在5%甲醛炎性痛模型Ⅱ相中的镇痛效应曲线

3 讨 论

内脏痛的临床表现复杂多样，同一部位的疼痛可能包含有多个内脏器官的痛觉信号，且内脏损伤程度与疼痛强度无确切联系，目前，内脏痛的伤害性刺激可分为机械性刺激、化学性刺激、缺血性刺激、电刺激、心理应激及温度刺激等，通过这些伤害性刺激引起内脏的伤害性反应从而建立起内脏痛模型。扭体反应模型作为经典的内脏痛实验模型，是通过腹腔注射乙酸、硫酸镁、乙酰胆碱、缓激肽等刺激壁层腹膜和腹腔脏器产生以体腔壁痛为主的内脏痛，引起弓背、腹部肌肉收缩、后肢伸展的行为改变。本研究通过预实验及参考姚明等[6]方法选择以2%醋酸腹腔注射作为内脏痛模型，剂量选择4 mL/kg均可出现扭体反应，且较为稳定，60 min内扭体次数大约为45次，之后基本不出现扭体。大鼠甲醛模型是急性组织损伤介导疼痛的经典试验模型[4]，通过足底注射甲醛后可出现双相疼痛行为改变，第一相疼痛的产生是炎性物质直接刺激伤害性感受器，产生伤害性刺激传导至中枢形成痛觉；而第二相反应的产生是因为肥大细胞释放组胺等炎性介质的外周机制使得中枢发生敏化而产生[7]，所以本文将5%甲醛50 μL足底掌侧注射作为炎性痛模型。本研究使用此上述两种实验模型探讨阿片类药物在内脏痛、炎性痛镇痛效应，并探讨羟考酮在内脏痛模型中发挥镇痛效应时κ受体与μ受体的占比。

本研究发现，腹腔给以吗啡及羟考酮均可呈剂量依赖性发挥镇痛效应，其中羟考酮ED50/吗啡ED50的比值在甲醛模型的Ⅰ相、Ⅱ相分别为1∶2.334、1∶1.69，而在醋酸扭体模型中为1∶2.94，即相较于炎性痛模型，羟考酮与吗啡的比值在内脏痛模型中较小，提示相较于炎性痛，羟考酮在内脏痛中可能具有更加优越的镇痛效果。有研究[8]认为，外周效应的不同可能在两种药物的镇痛效应中起到了重要作用。有研究[9]证实相同剂量的吗啡腹腔给药后可降低内脏痛模型的扭体次数，而静脉给药则没有任何镇痛作用，表明吗啡经腹腔给药时可能是通过外周效应发挥镇痛效应。而羟考酮作为半合成的阿片类药物，通过激动κ受体、μ受体发挥镇痛作用，且可通过主动运输跨越血脑屏障，发挥中枢性镇痛效应，有研究[10]发现，在甩尾试验和热板试验大鼠模型中，经鞘内给药后吗啡的镇痛效应为羟考酮的14倍，但经皮下和腹腔给药时羟考酮的镇痛效应为吗啡的2～4倍，可能与羟考酮的外周效应有关。在中枢神经系统及肺、消化道等外周器官中均有阿片受体分布，是阿片药物发挥镇痛作用的一个重要靶点，而且在炎症环境中，外周传入神经纤维末梢以κ受体为主的阿片受体表达增加[11]，因此羟考酮发挥镇痛的作用增强。Simonin等[12]发现，在醋酸扭体模型中，敲除κ受体基因的小鼠疼痛反应更剧烈，即对内脏痛更加敏感，使用κ受体激动剂可减轻疼痛反应，而μ受体基因敲除的小鼠对于热痛刺激更加敏感，提示κ受体对于内脏痛的形成至关重要。有研究使用低频振荡振幅算法静息态功能磁共振发现，与内脏痛形成的相关脑区活动异常[13]，而另有研究发现κ受体也广泛存在相关脑区中,提示κ受体在中枢效应中对内脏痛的形成也必不可少,具体机制仍有待探讨[14-15]。本研究发现，在以醋酸等化学物质引起的内脏痛及甲醛引的炎性痛中，羟考酮的镇痛作用均强于吗啡，且对于内脏痛的镇痛效应更强，可能与此有关，但具体机制仍需进一步研究。

羟考酮发挥镇痛效应时κ受体、μ受体各自的占比仍不清楚，本研究初步探讨在2%醋酸扭体模型中两者的比例，通过前期预实验得出κ受体、μ受体特异性拮抗剂的最佳给药剂量，通过得出的羟考酮ED50给药，计算扭体次数，初步估计κ受体、μ受体两者的比例为2.375∶1，提示在醋酸扭体模型中，羟考酮主要通过κ受体发挥镇痛作用，可能与内脏痛中κ受体起主要镇痛作用有关[9]。

综上所述，羟考酮及吗啡在内脏痛镇痛效应的差异可能与阿片受体的外周效应有关，本文也初步探讨了羟考酮在内脏痛模型发挥镇痛作用时的κ、μ受体各自的占比，但在内脏初级传入神经纤维末梢的μ、κ受体具体激活以及调控的分子机制方面，尚需进一步研究。