应用高温嗜热芽孢杆菌（Thermophilic Bacillus）和红曲霉菌（Monascus）生产“绵柔型”白酒的初步尝试

张 鑫，王凤仙，刘 帅，耿添霈，王元太

（1.山西杏花村汾酒厂股份有限公司,山西汾阳032205；2.山西省轻工业行业管理办公室,山西太原030002）

20世纪60年代初和90年代末，中科院微生物研究所和贵州省轻工业科学研究所以及山西老陈醋集团公司等都组织相关科研人员，分别从茅台酒的高温大曲，老陈醋高温发酵的醋醅和熏醅中分离得到许多耐高温的微生物种群，尤以高温嗜热芽孢杆菌和红曲霉菌备受青睐，随着对各种功能性微量成分的分析技术的日益进步，许多杂环类化合物，如四甲基吡嗪等对酒、醋等食品风味的影响，引起酿造界的广泛关注。21世纪初，中科院成都生物研究所的庄名扬先生最先指出，地衣芽孢杆菌等的发酵产物，伴随着美拉德反应可产生酱香味物质，如今四甲基吡嗪已被国标山西老陈醋确定为特征性微量成分，其含量可达60 μg/mL，可与茅台酒相媲美，高温芽孢杆菌与“三高”工艺相结合，已成为各类香型白酒提高质量的工艺措施之一。本试验选用的高温嗜热芽孢杆菌最高生长温度均在65℃以上，其中B4号菌为特基拉芽孢杆菌（Bacillus tequilensis），B7号菌为嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophillus），以及从中科院成都生物研究所引进的编号为1.017环状芽孢杆菌（B.circulens），1.020地衣芽孢杆菌（B.licheniformis），1.039枯草芽孢杆菌（B.subtilis），共5株芽孢杆菌。另有3株红曲霉菌，M1发白红曲霉（M.albidus），M2橙色红曲霉（M.aurantiacus），M3烟色红曲霉（M.fuliginosus）。以上菌株扩大培养的方法为单株培养，分别制曲，酿酒生产时按比例混合使用，以生产“绵柔型”清香型白酒为目标，并探讨其工艺改革和产品创新的可行性。

1 材料与方法

1.1 供试菌株的扩大培养

1.1.1 高温嗜热芽孢杆菌的扩大培养的工艺流程按下列工艺流程进行：

BPY培养基琼脂斜面菌株➝BPY液体试管（35℃）➝三角瓶麸皮原菌（35℃）➝曲盒曲种（35℃）➝大房麸曲➝通风干燥至水分≤12%➝备用工艺要点：三角瓶、曲盒、大房三级扩大培养培养基∶麸皮∶大曲粉碎料∶稻壳∶自来水（w/w）=100∶20∶5∶65，35 ℃培养，备用。

1.1.2 红曲米的扩大培养工艺流程

试管斜面菌株➝三角瓶大米原菌（35℃）➝曲盒红曲米（35℃）➝通风干燥➝红曲米

工艺要点：试管斜面菌株加1%乳酸水5～10 mL制成菌悬液，接种到三角瓶大米培养基，大米处理工艺为：大米加1%乳酸水浸泡8～12 h，控去水，每个500 mL三角瓶约装生米25 g，加棉塞后以121℃蒸汽灭菌30 min，然后每个三角瓶米饭约接种菌悬液2 mL，35℃培养5～7 d后，转接到大米曲盒培养，35℃培养4～5 d后，42℃通风干燥，得到红曲米，备用。

1.2 酿酒试验的工艺流程

高温润糁：大汽蒸糁按汾酒常规工艺进行。

大米查配料：w/w=高粱100∶大曲20%∶高温麸曲10%（其中B4号菌2%，B7号菌4%，1.017、1.020、1.039 3株菌的麸曲共4%），控制堆积料水分≤50%，用扬米查机拌匀。

高温堆积：堆积场温度保持35℃，起始堆积温度38℃，堆心升温至55℃，堆积1～2 d，直至堆层表面出现“白头”。

高温发酵：地缸入缸温度≥38℃，试验发酵周期40 d。

蒸馏：成品酒接酒酒精度56%vol。

二米查发酵：因大米查酒醅酸度过高，成为不发酵的死醅，按正常加曲后入不锈钢窖池，发酵期为28 d，出池酒醅的香味成分用超临界萃取法萃取，以探索杂环类化合物等特征性微量成分的种类和含量。

2 结果与分析

2.1 试验酒品评

酒样编号进行暗评，品评者为4位具有国家级评酒资格，2位有资深的评酒和酿酒工作经历，有较好的公正性和可信度。结果见表1。

2.2 试验酒的常规理化分析

试验酒为高酸高酯酒，卫生指标符合企业内控标准，优于国标GB 2757的相关规定，见表2。

3 结论

3.1 试验酒的总体评价

色泽：无色、清亮透明，外观着色较深、稍挂杯。

香气：清香复合，有酱感，微酸杂，或略有酸杂异香。

口味：绵长柔和，后口略有酸杂异味。

风格：酒体有特色，与现产汾酒对比有较大差距，是清香型酒，但不是汾酒。

以上评语由试验组整理，获得汾酒集团质量检测中心主任、国家级著名评酒专家王凤仙首席大师认可。

“有酱感”：采用高温嗜热芽孢杆菌与“三高”工艺相结合，生产的试验酒有酱感，说明含有酱香特征的微量成分，尽管该成分目前尚不能定性，但可知主要来自耐高温嗜热芽孢杆菌，试验用量最大的麸曲是用嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophillus）制作的。所谓闻香和口味有酱感，与“绵柔型”是互为表里的。试验酒2号比1号好，说明陶缸比不锈缸发酵好。

表1 试验酒样的品评意见

表2 试验酒常规理化分析结果

“高酸酯”：经常规分析，试验酒的总酸≥3 g/L，总酯≥8 g/L，属高酸高酯酒，成品酒的酸酯主要来自发酵酒醅，能在酒醅中产酸的微生物种群，主要有乳酸菌，其主要产乳酸；另类的产酸菌主要有芽孢杆菌，该菌从高温醋醅中分离出来，主要产醋酸及其他多种有机酸。酸的种类和含量在很大程度上决定成品酒和老陈醋的口感绵长柔和的特点，在上述产酸微生物形成的“三高”酒醅中，红曲霉菌参与发酵，从红曲霉的生态特性可知，红曲霉耐高酸，嗜乳酸、耐乙醇、耐高渗透压（耐高糖），能在酒醅和醋醅的高温、高酸条件下生长繁殖和发酵，加上红曲霉微产酒精，产多种有机酸、维生素和色素，并有特强的酯化能力，赋予各种红曲食品的独特风味。多品种高含量的有机酸，为“绵柔型”口感奠定了基础，在山西老陈醋的口感上或可定义为酸味柔和，食而绵酸；在白酒口感上或可定义为绵长柔和。

“清香复合”在“三高”工艺中有一种功能性微生物，即东方伊萨酵母（Issachenkia orientalis），是在本次试验中高温堆积在醅料表层出现的“白头”，“白头”具有浓烈的青苹果香气，江南大学教授徐岩认为，该菌发酵产生的萜烯类化合物对汾酒的清香风格有较大贡献。该菌产酒精，合成酯能力强，可与异形汉逊酵母相等同，王元太认为，伊萨“白头”的清香风格特征与异形汉逊酵母（Hansenala anomala）形成的“白头”的清香有所区别，前者以清香为主，偏重苹果香气；后者以甜香为主，偏重于香蕉气味，两者比较，以东方伊萨“白头”形成的清香更加典雅，与试验酒的“清香复合”有关，也是试验酒高酯的原因之一。

3.2 试验存在的问题及其工艺改进意见

试验酒有酸杂异味，其主要原因是酒醅酸度过大、大米查流酒少、二米查成为不发酵的死醅，在今后的试验中要注意防酸、控酸，减少用曲量，降低堆积升温，缩短堆积时间，并可相应提高出酒率。为提高现产汾酒的清香风格，可制造东方伊萨酵母的固态麸曲酵母，在入缸前与发酵酒醅一起高温晾堂堆积发酵1 d，成品酒可突出清香风格；为不影响试验酒的出酒率，用二米查酒醅试验效果更好。

试验酒的微量成分和功能性微量成分，如杂环类化合物、萜烯类化合物等的分析检测应进一步完善分析。

本试验仅是一次性探讨，分离鉴定的5株高温嗜热芽孢杆菌只试验了2株，高温放线菌尚为空白，强化高温大曲尚未进行，有待后续研究。