miR—493在骨肉瘤组织中表达及其临床意义

曹平

【摘要】 目的：探討miR-493在骨肉瘤组织中表达情况及其表达与患者各临床参数之间的关系。方法：回顾性分析本院2012年1月-2016年7月的32例骨肉瘤组织标本和41例骨软骨瘤组织标本，骨软骨瘤标本作为对照，采用RT-PCR法检测标本中miR-493相对表达量。分析骨肉瘤标本及骨软骨瘤标本，分析转移组与未转移组，复发组与未复发组标本miR-493表达差异。以中位数为界分为miR-493高表达组与miR-493低表达组，分析骨肉瘤临床特征与miR-493表达的关系。结果：miR-493在骨肉瘤标本组中表达量低于骨软骨瘤组织（1.025±0.122 vs 2.369±0.255，P<0.05），转移组表达量低于未转移组（0.768±0.132 vs 1.033±0.136，P<0.05），恶性程度高组中表达量低于恶性程度低组（0.642±0.102 vs 0.967±0.0.095，P<0.05）。32例骨肉瘤组织miR-493表达量中位数为0.728（0.213，1.548），患者年龄、性别和肿瘤侵袭部位与miR-493表达水平无相关性（P>0.05）。肿瘤越大、恶性程度越高、复发和发生转移的骨肉瘤标本miR-493表达相对较低。结论：miR-493在骨肉瘤组织呈现低表达，miR-493与骨肉瘤肿瘤越大、恶性程度越高、复发和发生转移密切相关。

【关键词】 骨肉瘤； 微小RNA； 肿瘤复发

The Expression and Clinical Significance of miR-493 in Osteosarcoma/CAO Ping.//Medical Innovation of China，2018，15（16）：0-065

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of miR-493 in osteosarcoma and the relationship between the expression and clinical parameters of osteosarcoma.Method：A total of 32 cases osteosarcoma specimens and 41 cases osteochondroma specimens in our hospital from January 2012 to July 2016 were analyzed retrospectively，osteochondroma specimens was control group.The expression of miR-493 was detected by RT-PCR analysis of specimens.ThemiR-493 expression differencees were analyzed between metastasis group and non-metastasis group，recurrence group and non-recurrence group of osteosarcoma specimens and osteochondroma specimens.The miR-493 high expression group and miR-493 low expression were analyzed the relationship between the expression of miR-493 and clinical features of osteosarcoma specimens.Result：The expression of miR-493 in osteosarcoma specimens group was lower than bone tissue chondroma （1.025±0.122 vs 2.369±0.255，P<0.05）， expression was lower than for the transfer of cases transferred group （0.768±0.132 vs 1.033±0.136）， the expression of high malignancy group was lower than that of low malignant group （0.642±0.102 vs 0.967±0.0.095，P<0.05）.The median expression of miR-493 in 32 cases of osteosarcoma was 0.728 （0.213，1.548）.There was no correlation between the age， sex and the location of tumor invasion and the expression level of miR-493（P>0.05）.The higher the degree of malignancy，the higher the degree of malignancy，the higher the recurrence and metastasis of osteosarcoma，the lower the expression of miR-493.Conclusion：miR-493 is low expression in osteosarcoma，and miR-493 is closely related to bigger tumor size，higher the degree of malignancy，recurrence and metastasis of osteosarcoma.

【Key words】 Osteosarcoma； miRNA； Tumor recurrence

First-authors address：Tianyou Hospital Affiliated to Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430064，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.16.018

骨肉瘤是常见的骨肿瘤之一，主要发生于10～20岁青少年的肢体骨干骺端，骨肉瘤起源于间质组织，细胞呈梭形，是一种恶性肿瘤[1-2]。骨肉瘤恶性程度高、侵袭性强、局部复发率高以及进展快，严重危害了青少年的身体健康。现代肿瘤分子生物学和分子遗传学的发展为骨肉瘤的治疗提供了新方法，包括基因治疗、分子靶向治疗和基因预后评估等[3]。研究表明，骨肉瘤的发生和发展与原癌基因的异常激活或抑癌基因的异常失活密切相关，发现新的标记基因对骨肉瘤的早期诊断和预后具有非常重要的意义[4]。

miRNA是属于小分子非编码RNA，与mRNA的3端非编码区域结合而调控下游基因[5]。miRNA参与了骨肉瘤细胞增殖、侵袭转移及发生发展等多个生理过程。研究表明，miR-493在肺癌、肝癌、胃癌等肿瘤组织中呈现低表达，可能是一种抑癌基因[6-10]。然而，miR-493在骨肉瘤组织中的表达及其作用仍不明确，本研究拟分析miR-493在骨肉瘤组织中的表达情况，并分析其表达与临床特征之间的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 32例骨肉瘤组织标本和41例骨软骨瘤组织标本均来自本院2012年1月-2016年7月的患者。纳入标准：所有骨肉瘤和骨软骨瘤良性肿瘤患者都经病理、X线及CT扫描明确诊断，包括股骨下段、胫骨上段、桡骨远端常见部位及其他短骨和扁平骨不常见部位的骨肉瘤或骨软骨瘤。排除标准：排除复发患者，合并严重心脑血管疾病患者，不愿意资源参加项目研究的患者。统计分析所有患者临床资料，包括年龄、性别、是否转移、恶性程度等。所有标本在离体后迅速放入液氮中，并转移至-80 ℃超低温冰箱保存。本研究通过了本院伦理委员会审核，签署患者知情同意书并遵循临床相关研究伦理规定。

1.2 荧光定量PCR检测组织标本 （1）Trizol法提取组织标本的总RNA：取适当质量的待检组织，加入Trizol（Invitrogen），充分匀浆，按照Trizol法提取总RNA。通过紫外光谱法检测总RNA浓度和纯度。（2）逆转录合成cDNA：经3段 poly（A）加尾处理后，将RNA中加入0.5 μg寡核苷酸，75 ℃变性5 min，稀释成12.5 μL。冰浴30 s，加入RNA酶抑制剂、10 nmol的dNTP混合物和第一链缓冲液，42 ℃下孵育5 min；加入逆转录酶（Invitrogen）反应50 min。最后置于70 ℃下15 min，终止反应。（3）PCR过程：引物设计合成由广州锐博完成，5-TGTGATTGGAATGGAAATTTAATTT-3；反向引物5-ACTATCCTACACTCC CCTACCCTAC-3，采用2-△△方法进行定量分析，以U6作为内参，正向引物5-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3，反向引物5-GGAACGCTTCACGAATTTG-3。RT-PCR

反应体系为：5.0 μL的cDNA，0.75 μL正向引物，

0.75 μL反向引物，12.5 μL的SYBR Green荧光染料（上海闪晶分子生物）和6.0 μL DEPC水。PCR反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 45 s，45循环；65 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min；72 ℃ 10 min。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，两组之间比较采用t检验，多组间比较用方差分析；计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者的一般资料比较 骨肉瘤组织标本组年龄14～28岁，平均（17.6±4.8）岁；男20例，女12例；转移16例，未转移16例；恶性程度高18例，低14例，所取得标本术前未接受放疗或化疗。骨软骨瘤组年龄24～38岁，平均（31.7±5.9）岁。

2.2 两组miR-493表达水平比较 miR-493在骨肉瘤标本组中表达量为（1.025±0.122）低于骨软骨瘤组（2.369±0.255），出现转移病例组表达量（0.768±0.132）低于未转移组（1.033±0.136），恶性程度高组中表达量（0.642±0.102）低于恶性程度低组（0.967±0.095），比较差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.3 miR-493表达水平与骨肉瘤的临床指标间的关系 32例骨肉瘤组织miR-493表达量中位数为0.728（0.213，1.548），以中位数为界限将骨肉瘤患者分为miR-493高表达组与miR-493低表达组，进一步分析miR-493表达水平与骨肉瘤臨床指标间的关系，患者年龄、性别和肿瘤侵袭部位与miR-493表达水平无相关性（P>0.05）。见表1。

3 讨论

复发和远处转移是影响骨肉瘤治疗的两个关键因素，有学者提出，几乎所有骨肉瘤患者在门诊或住院确诊时已经出现了微转移，肿瘤细胞进入血液循环[11]。因此辅助化疗对恶性程度高的骨肉瘤患者是必要的治疗手段，经过辅助化疗将肿瘤初步控制在原位之后，再行手术治疗，则优于单纯手术治疗的疗效[12]。尽管如此，骨肉瘤远期生成率仍较低，多数患者在经过反复化疗之后仍然出现远处转移和复发等，因此，骨肉瘤（尤其是已经明确有转移的骨肉瘤）仍缺乏有效的早期诊断和治疗措施[13]。骨肉瘤对化疗药物的耐药作用是骨肉瘤化疗失败的常见原因之一，此外，患者不能耐受化疗药物的副作用、经济条件限制及基层医院缺乏规范的治疗策略，可能影响骨肉瘤的治疗疗效。

miRNA在转录后水平调控细胞的生物学功能，miRNA在肿瘤诊断和治疗领域的作用备受关注[14-15]。本实验研究表明，miR-493在骨肉瘤标本组中表达量低于骨软骨瘤组织，出现转移病例组表达量低于为转移组，恶性程度高组中表达量低于恶性程度低组，并且卡方检验表明，miR-493与骨肉瘤患者临床特征如恶性程度越高、复发和发生转移存在相关性。基于miR-493在骨肉瘤患者组织中的表达特点，miR-493相对表达量较高的骨肉瘤恶性程度越低、复发和转移的风险越低，因此，可以初步推断，miR-493可能抑制了骨肉瘤发生发展。不同miRNA在骨肉瘤组织或血液中有高表达和低表达的现象并不少见，已经被许多骨肉瘤组织的基因芯片检测所证实。高表达或低表达的miRNA在骨肉瘤中的关键作用则有待进一步研究，一般来说，高表达miRNA可能作为骨肉瘤的诊断标志物，是一种癌基因，而低表达的miRNA则肯能起到抑癌基因的作用，将来可能作为抗肿瘤的新的靶点之一。研究表明，多种miRNA在骨肉瘤标本中呈现低表达，且在骨肉瘤细胞系中也低表达，人们认为，这些下调的基因可能起到抑制骨肉瘤增殖和转移的作用[16]。陈翔等[17]发现，miR-140在样本中的表达明显低于其在周围正常组织中的表达，白马恒等[18]研究表明，miR-194与骨肉瘤患者各临床参数如年龄、肿瘤临床分期、远端转移和生存率等存在显著相关性。还有报道表明，miR-493通过调控靶基因抑制肺癌、肝癌细胞的增殖、侵袭和转移。

本研究基于临床标本和患者临床数据表明，miR-493在骨肉瘤中低表达，可能起到抑癌基因作用，miR-493在骨肉瘤细胞中的作用机制有待进一步的细胞和动物实验研究。本研究的不足之处在于，骨肉瘤的样本量仍偏少，且仅限于分析了本院近几年收治的患者范围。因此本研究将进一步扩大样本量及纳入的地区范围，增加统计分析的可信度。此外，本研究将从细胞和动物实验水平深入探讨miR-493对骨肉瘤增殖、凋亡、细胞周期以及侵袭转移等生物活性的影响。

综上所述，miR-493在骨肉瘤组织呈现低表达，miR-493与骨肉瘤肿瘤越大、恶性程度越高、复发和发生转移密切相关。

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（收稿日期：2017-11-06） （本文编辑：周亚杰）