生物三维打印细胞负载水凝胶类组织的精准优化

黄孟杰 罗 莉 王 玲,2* 徐铭恩,2*

1(杭州电子科技大学生命信息与仪器工程学院，杭州 310018) 2(浙江省医学信息与生物三维打印重点实验室，杭州 310018)

引言

生物三维打印[1-3]基于快速成型分层制造原理，可以将多种生物材料和细胞精准定位组装到设计位置，形成三维类组织，为制造非均质、复杂结构组织器官提供新的理论和技术。水凝胶具有良好的亲水性、生物相容性、生物可降解性以及活细胞包裹能力，对于生物三维打印在组织工程和再生医学领域的应用极具吸引力[4-5]。生物三维打印和水凝胶的完美结合，为制造复杂结构功能的组织器官提供了一种激动人心的解决方案。3D纤维沉积(fiber deposition, FD)和3D生物绘图(bio-plotting, BP)技术均属于生物三维打印技术，曾成功用于制造具有可复制形态特性的多孔水凝胶结构[6]，例如，Wang等基于3D FD的生物3D打印技术，成功制造出可控孔形和孔尺寸分布的多孔水凝胶/肝细胞复合结构，且打印结构具有良好的可复制性[7]。

生物三维打印定制化支架的内部结构可以更好地仿生真实组织器官的三维微环境，满足组织形成对几何、机械、流体运输等的特殊要求，有利于体外培养时细胞生长、组织形成和功能重建。然而，由于水凝胶特有的溶胀特性及组成成分的多变性，打印后的结构形态参数与设计值出现明显差异。例如，He等的研究发现，水凝胶打印成形过程中相邻层会出现坍塌和融合现象，从而引起z方向的累计误差[8]。此外，Shim等基于3D BP技术制备水凝胶支架，发现单一成分水凝胶打印出的支架机械性能较差，会出现支架支撑的局部断裂[9]。上述研究表明，实际打印与预先设计在结构形态上存在显著差异，而细胞负载水凝胶类组织的这些局部或整体的结构差异会严重影响其机械、液体传输等特性，进而影响类组织内的细胞活性和功能。

现有的研究提出，通过优化打印参数来提高打印精度和保持细胞活性。例如：Chang等的实验发现，生物三维打印过程中点胶压强和喷头尺寸会影响细胞活性[10]；Billiet等进一步系统研究各打印参数对打印结果的共同作用，具体到水凝胶的浓度、打印温度、打印压强、打印速度以及细胞浓度等，提出适用于其实验水凝胶材料成型和细胞高活性的具体打印参数设置[11]。上述研究的重点在于如何同时保持打印结构的稳定性和细胞的高活性，但如何打印出与设计尽量匹配的水凝胶制品仍旧是空白。批量打印工程化组织和打印制品的大规模应用，不仅要求打印结构稳定和细胞活性，更要求打印与设计的精准匹配。按照预设结构精准制备细胞负载水凝胶支架，提高打印的可控性和保真度，对生物三维打印技术在组织工程和再生医学中的应用具有重要意义。

生物三维打印细胞负载水凝胶类组织的精准优化控制，精确量化打印结构与设计值的差异是优化控制的基础，需要定量表征打印细胞负载水凝胶类组织的结构特征。传统的扫描电镜、光学显微法很难获得打印类组织的三维内部结构信息，Micro-CT可以获得打印类组织的三维内部结构，但是X射线对于高含水量水凝胶材料吸收对比度低，离子效应也会伤害细胞，不适合细胞负载水凝胶类组织的在体成像和表征。光学相干层析成像(optical coherence tomography, OCT)[12]能够实时非侵入式地获取样品结构的横断面图像，成像分辨率可以达到1～15 μm，对高散射样品的成像深度达到数毫米[13]。OCT依靠近红外低相干光干涉成像，对细胞损伤低，高含水量样品成像对比度高，已广泛用于组织工程实时监测研究[14]，本研究小组在前期的工作中也证实了OCT技术用于水凝胶支架定量表征和精准控制的可行性[15-17]。

本研究提出基于OCT三维定量表征的细胞负载水凝胶类组织的精准优化打印方法，通过OCT三维定量表征迭代，降低设计与打印间的结构差异，提高细胞负载水凝胶打印的精准性和稳定性。在研究中，设计和打印了10种不同孔隙结构的细胞负载水凝胶类组织，采用自制的三维扫频OCT系统，无损在线成像打印组织块和定量评价孔隙尺寸(pore size, PS)、支撑尺寸(strut size, StS)、孔隙率(porosity, VP)、体表面积(surface area, SA)、孔体积(pore volume, PV)等关键结构参数；通过不同时间段批次打印稳定性评价和同一批次打印参数关联耦合分析，获得反馈控制打印的经验函数，结合打印参数优化指导精准打印；最后经负载C3A细胞类组织内的细胞活性分析，验证反馈优化打印的有效性。

1 材料和方法

1.1 生物3D打印平台搭建

生物3D打印平台在杭州捷诺飞生物科技股份有限公司的Bio-Architect®-Pro基础上搭建，生物3D打印设备外观和系统构成如图1所示。该设备由软件系统和硬件系统两部分构成：软件系统部分包括模型处理和设备控制， 能对模型的再编辑和分层处理以及控制温度、气压、三轴运动；硬件系统部分包括控制系统和机械系统，其中控制系统包括温度控制模块、气压控制模块和三轴运动控制器，机械系统部分包括终端执行功能的打印喷头、打印平台、三轴运动模组、自动喷头清洁、自动对高和平台测高等部件。该设备可以对气压和温度进行精确调控，并能在打印过程中实时调控打印参数。

图1 生物3D打印设备和系统构成。(a)Regenovo公司生产的Bio-Architect®-Pro外观；(b)系统构成Fig.1 Biological 3D printing equipment and system constitution.(a) Bio-Architect®-Pro manufactured by Regenovo; (b) System architecture

1.2 OCT成像和表征

生物3D打印水凝胶支架的成像采用本团队之前开发的一套高速高分辨扫频OCT系统[18]，系统实物和关键性能指标如图2和表1所示。

图2 系统实物Fig.2 Physical picture

在成像过程中，细胞负载水凝胶类组织浸没在培养液中，并密封在培养孔板内，以确保细胞营养供应和无菌干扰，每次成像在培养孔板上标记成像的视场范围。获取的高分辨3D OCT图像通过已论证的算法[15-17]，自动量化打印细胞负载水凝胶类组织的结构参数，包括PS、StS、VP、SA、PV，并与设计值做比较，定量表征流程如图3所示。

1.3 C3A细胞负载水凝胶类组织打印

将配制好的明胶溶液和海藻酸钠溶液按体积比1∶1混合均匀，加入重悬浮的C3A细胞悬液，制得细胞密度为6×106个/mL的混合物。将细胞-水凝胶混合物转移到打印机配置的低温墨盒中，选用210 μm喷头，将墨盒置入成型室的低温喷头中。支架的设计采用以往类组织打印验证可行的正交联通立方体结构设计[19]，结构形状不变，仅改变结构体的PS，按照PS的不同，分别将设计和打印的结构定义为po250、po300、po350、po400、po500、po600、po700、po800，立方体外形尺寸为10 mm×10 mm×2 mm。第一次试验组，同一批次关联测试打印po300、po400、po500、po600、po700、po800，每批重复打印5次。不同批次跨越6个月时间打印同一结构po600，每批重复打印5次。打印参数设置如下：打印气压0.42 MPa，打印速度8 mm/s，喷头温度4℃，平台温度4℃，层高0.1 mm。待支架成型后，滴加5%无菌氯化钙溶液适量，交联固化30 s后，移除氯化钙溶液，用无菌DPBS溶液洗涤支架，反复冲洗3遍，最后加入适量完全培养基，置于CO2培养箱进行常规培养。第二次生产组要求打印出定制的孔尺寸为250和350 μm，分为两组，控制组直接设置孔尺寸为250和350 μm，优化组根据第一次试验组的反馈设置打印结构参数和工艺参数。

表1 OCT系统关键性能指标Tab.1 Key performance indicators of OCT system

图3 基于OCT的支架结构表征流程Fig.3 General flow chart of the scaffold structure characterization based on OCT

1.4 打印C3A细胞负载水凝胶类组织结构测试

对制备好的细胞负载水凝胶类组织常规培养1天，再通过自制的OCT系统进行内部结构检测分析。OCT检测时，整个培养孔板的打印类组织保持密封，且整个孔板内样品的图像采集时间不超过30 min，以尽量减少检测对类组织的活性影响。分别对第一次试验组同一批次打印的6种不同尺寸的细胞负载水凝胶类组织、不同批次打印的po600以及第二次生产实验优化组细胞负载水凝胶类组织进行OCT成像和定量表征，分别随机选择5个打印出的样本做结构测试分析，比较各参数与设计值的统计差异；分析差异间的关联性，测试迭代分析方法是否能显著降低设计和打印结果的差异。

1.5 打印细胞负载水凝胶类组织生物活性测试

生物活性检测实验，是为了比较结构控制优化前后细胞存活特性上的差异。在制备完细胞负载水凝胶类组织后的第1、7和14 d，利用活、死细胞活力/毒性检测试剂盒来检测支架里细胞的存活率。将染色试剂加入细胞负载水凝胶类组织中，确保浸没结构体。将其在37℃黑暗环境下培养1 h后，吸出染色试剂，用无菌DPBS溶液反复洗涤支架3次，最后在荧光倒置显微镜下观察。随机选择样品(一组3个类组织样品)5个不同位置并拍照荧光显微图，细胞存活率(cell viability,CV)的计算如下：

(1)

1.6 整体精准优化控制方法

基于OCT的细胞负载水凝胶类组织的精准优化打印方法，该方法包括设计、打印、成像、表征、分析、反馈的两次闭环，基础装置是多参数可控的生物三维打印设备和打印类组织的OCT定量分析装置，如图4所示。第一次试验闭环：设计适合细胞生长要求及组织成型机械要求的多孔支架结构；通过多参数可控的生物三维打印装备，将细胞/明胶/海藻酸纳混合液按照设计结构装配成三维组织模型，实验选用C3A细胞；利用OCT成像技术，定量表征分析支架的结构参数，比较分析实际打印结果与预设参数的差异，并反馈给第二次生产闭环。第二次闭环：结合差异相关分析和三维打印工艺过程优化，通过迭代方法降低打印支架与设计的形态差异，从而获得定制化的打印结构，最后进行直接打印，与精准定制打印类组织的生物活性对比，测试精准打印的效果。

图4 整体方法示意图Fig.4 Schematic diagram of the whole method

图5 6种不同PS细胞负载水凝胶类组织宏观图，线框为OCT成像范围。(a)po300；(b)po400；(c)po500；(d)po600；(e)po700；(f)po800Fig.5 Macrographs of the 6 different geometries hydrogel scaffolds, OCT imaging range in the frame. (a)po300; (b)po400; (c)po500; (d)po600; (e)po700; (f)po800

2 结果

2.1 细胞负载水凝胶类组织的打印和OCT成像

基于生物3D打印平台，可以成功制备预设的不同PS的细胞负载水凝胶支架，打印的C3A细胞负载水凝胶类组织浸没在DMEM培养基溶液的立体照片如图5所示。对比图像，证实该打印系统能够制备不同PS的三维支架，可以观测到不同预设PS的类组织有明显的孔隙结构差异，PS较小的类组织块(如po300、po400)表面有孔隙堵塞的现象，且孔隙形状不是很规整，形状发生些许变化，而po500～po800支架的孔隙形状则规则许多。但是，立体照片不能给出打印类组织内部的结构特征。

图6展示了打印类组织的OCT检测序列。从OCT的横截面图像(XZ)可以看出，OCT成像技术对高含水量细胞负载水凝胶类组织的成像深度可达到2.0 mm，成像分辨率可以达到微米级，足够分辨打印类组织的内部结构特征。打印类组织的实体支撑部分在图像中显示为灰白色，而灰白部分中间夹杂着的黑色部分为类组织的孔隙区域。对比OCT图像可以看出，po300和po400图像的内部较多地出现孔隙融合的情况(见图6(a)、(b))，主要是由于水凝胶材料本身溶胀，引起打印精度下降。随着预设尺寸的增大，可以明显观察到孔隙融合这种现象相应减少(见图6(c)～(f))。图6(a)～(e)的OCT横截面图像中出现了细胞负载水凝胶区域部分缺失的现象，是预设的内部横向通道截面，这在二维显微图像中很难观测到；从图6(a)～(c)和(d)～(e)的对比也可以看出，在预设孔隙较小的时候，预设的内部横向通道更容易出现坍塌和堵塞，这是由于孔隙小时水凝胶溶胀引起的打印误差比率更大。

图6 6种不同PS细胞负载水凝胶类组织OCT-XZ序列图。(a)po300；(b)po400；(c)po500；(d)po600；(e)po700；(f)po800Fig.6 OCT-XZ images of the 6 different geometries hydrogel scaffolds.(a)po300; (b)po400; (c)po500; (d)po600; (e)po700; (f)po800

图7 6种不同PS细胞负载水凝胶类组织三维渲染图。(a)po300；(b)po400；(c)po500；(d)po600；(e)po700；(f)po800Fig.7 3D rendering images of the 6 different geometries hydrogel scaffolds.(a)po300; (b)po400; (c)po500; (d)po600; (e)po700; (f)po800

OCT除了观测打印类组织的二维内部结构特征，还可以通过三维重建再现类组织的三维结构特征。图7为对应的体绘制三维渲染，可以更清楚地观测到类组织的立体显微特征：图7(b)～(c)、(f)可以观测到打印过程流涎，导致在孔区域出现不规则细丝；(a)、(d)可以观测到大面积的打印缺失；(e)可以观测到正交的联通通道。同时，3D OCT还可以通过图像分割，分别得到打印类组织的内部通道和实体支撑部分的分布信息(见图8、9)，可以更方便地分析三维打印缺陷，便于第二次生产组的打印过程指导和工艺优化。

图8 6种不同PS细胞负载水凝胶类组织孔隙三维重建图。(a)po300；(b)po400；(c)po500；(d)po600；(e)po700；(f)po800Fig.8 3D pore reconstruction images of the 6 different geometries hydrogel scaffolds.(a)po300;(b)po400; (c)po500; (d)po600; (e)po700; (f)po800

图9 6种不同PS细胞负载水凝胶类组织水凝胶支撑三维重建图。(a)po300；(b)po400；(c)po500；(d)po600；(e)po700；(f)po800Fig.9 3D strut reconstruction images of the 6 different geometries hydrogel scaffolds.(a)po300; (b)po400; (c)po500; (d)po600; (e)po700; (f)po800

2.2 细胞负载水凝胶类组织的打印可控性和稳定性

2.2.1批内打印的可控性

通过迭代降低打印与预设的差异，首先需要确定生物三维打印系统和工艺是否具有可控性和稳定性。本研究通过同一批次PS均匀递增的类组织的打印和量化分析，确定打印的可控性。实验设计了po300、po400、po500、po600、po700、po800共6组水凝胶类组织，并各自重复打印5次，随后根据3D OCT成像和图3提到的量化分析算法，获得和统计6组类组织包括PS、StS、 VP、 SA、 PV在内的结构参数。从表2中的方差来看，同一时间打印细胞负载水凝胶类组织，具有较好的打印稳定性。相比二维显微图像，3D OCT不仅可以得到表面的孔隙和支撑信息，也可以得到三维体信息，如VP、SA、PV。

同时，本研究比较了实际打印类组织的结构参数与预设值之间的差异，如图10所示。可以看出，PS、StS、VP、SA、PV的差值区间分别为28%～40%，32%～38%，14%～38%，18%～30%，13%～38%，表明实际打印与预设之间存在明显差异。

表2 PS、StS、VP、SA和PV的平均值和方差Tab.2 The average and variance of PS, StS, VP, SA, PV

图10 5个量化参数的对比分析(图中以百分比表示的数据为实际打印与预设打印的差值/预设打印值)。(a)平均实体StS；(b)平均PS；(c)平均VP；(d)平均SA；(e)平均PVFig.10 Average PS, StS, PV, SA and PV calculated using OCT image analysis and compared to the respective designed geometries(The data in the pictures are the ratio of the difference between the actual print and the preset print to the preset print value).(a)StS; (b)PS; (c)VP; (d)SA; (e)PV

为了进一步确定是否可以用量化的打印结构参数迭代优化指导第二次打印，笔者分析了实际打印的结构参数与预设变量间的关联性，以均匀变化的预设PS为自变量，基于量化的打印结构特征统计数据分析，分别将实际测得的PS、VP、SA和PV与预设PS做最小二乘函数拟合分析，分析结果如图11所示。其中，(a)～(d)分别展示了支架的实际PS、VP、SA、PV与预设PS值的相关性，经验相关分析结果呈现良好的线性相关性，证实了根据第一次闭环实验总结出的经验相关函数可以作为第二次闭环实验中打印的输入函数，用来反馈调整第二次打印细胞负载水凝胶类组织的设计与制备。

图11 实际结构尺寸与预设PS的相关函数分析。(a)实际PS与预设PS；(b)实际VP与预设PS；(c)实际SA与预设PS；(d)实际PV预设PSFig.11 Function analysis of actual structure size and preset PS. (a) as-produced PS; (b) as-produced VP; (c) as-produced SA; (d) as-produced PV

2.2.2批间打印的稳定性

为了确定打印系统的稳定性，测试了不同时间同样设计的细胞负载水凝胶类组织的打印差异。po600在6个月的时间里打印了6次，每次至少打印5个类组织样品，打印参数设置一致；经过3D OCT成像、量化表征和统计分析，得出6个月、6个时间点该设计实际打印的PS差别不大，统计出最大值和最小值之间的差异仅为11 μm，StS、VP、SA、PV的变化均无显著性差异，符合本实验对生物三维打印系统稳定性的要求。

2.3 验证迭代分析指导打印的结构优化有效性

图12 迭代改进后类组织的OCT-XY横截面图像。(a)po250；(b)po350Fig.12 The second OCT-XY image of scaffold structures after interactive analysis.(a)po250; (b)po350

为了验证本研究提出的迭代分析和反馈指导的优化打印方法是否能有效地根据定制的形态结构制备出细胞负载水凝胶类组织，期望平均PS为250和350 μm的类组织被重新设计。以第一次闭环实验中制备的类组织结构差异为输入，结合图11的迭代分析，为了得到实际PS为250和350 μm的类组织，第二次打印类组织的PS需要分别设置为390和540 μm。同时，根据图6～9的OCT成像和重建结果，结合之前的打印工艺测试经验，将打印参数设置为：打印气压0.43 MPa，打印速度8.5 mm/s，喷头温度为5℃，平台温度4℃，层高0.1 mm，两组类组织在新的参数下各自重复打印5次。待再次打印制备完成后，对两组共10个类组织样品做OCT图像采集，经过图像处理后统计计算的OCT-XY横截面的成像结果和三维重建图如图12、13所示。

图13 迭代改进后类组织的三维重建图。(a)po250；(b)po350Fig.13 The 3D reconstruction image of scaffold structures after interactive analysis.(a)po250; (b)po350

观察分析po250和po350细胞负载水凝胶类组织的OCT-XY图像和三维重建图，可以看到细胞负载水凝胶类组织整体的完整性，同时也可以看到打印类组织孔隙通道基本联通，支撑柱体高度一致且无明显粘连。相比而言，po250仍有部分孔变形的问题，但基本没有孔隙堵塞和孔融合的问题(见图12(a)、13(a))。po350的结构形貌更好地保持了设计的结构特征(见图12(b)、13(b))，保持了方形的孔道结构特征，这从另一个侧面验证了大孔隙结构更容易控制打印精度。进一步的结构参数量化表征以及与预设值的对比分析结果如图14所示。可以看出，与预设值的结构差异已控制在7%以下，极大提高了打印的准确性和保真度。

图14 迭代改进后类组织的结构参数对比分析(图中以百分比表示的数据为实际打印与预设打印的差值/预设打印值)。(a)PS；(b)StS；(c)VP；(d)PV；(e)SAFig.14 Calculated from OCT images compared to the respective values calculated from the empirical correlation functions (The data in the pictures are the ratio of the difference between the actual print and the preset print to the preset print value). (a)PS; (b)StS; (c)VP; (d)PV; (e)SA

2.4 直接打印和优化打印细胞活性对比

为了测试优化打印是否有利于类组织的生物活性重建，本研究比较了同样预设PS直接打印和优化打印后的类组织内细胞活性随时间的变化情况。图15给出po250、po350直接打印和优化打印细胞负载水凝胶类组织打印后体外培养7、14 d的细胞活性染色的显微图像，其中，绿色荧光是被染色的活细胞，红色荧光是被染色的死细胞。由图15的对比可以看出，直接打印组图中的红色荧光较多，即死细胞数目多，而优化打印组图中的红色荧光部分明显比同行的直接打印组的少，证明直接打印细胞负载水凝胶类组织不利于细胞活性的维持。

图15 迭代改进前后类组织内的细胞荧光显微图(左为迭代改进前，右为迭代改进后；上为第7 d，下为第14 d)。(a)po250；(b)po350Fig.15 The cell fluorescence microscopy image of C3A cell in the scaffold structures after interactive analysis (the left for before iterative improvement, the right for after iterative improvement; the top is the 7th day, the bottom is the 14th day.).(a)po250; (b)po350

量化分析po250、 po350直接打印和优化打印体外培养1、7、14 d的细胞活性情况，如图16所示。po250直接打印体外培养1、7、14 d的细胞活性分别为91.0±2.22%、85.5±1.70%、83.4±3.76%，对应的优化打印的细胞活性分别为92.1±2.78%、95.0±1.03%、96.1±2.79%；po350直接打印体外培养1、7、14 d的细胞活性分别为90.3±4.00%、92.6±1.65%、91.6±1.57%，对应优化打印的细胞活性分别为91.2±2.45%、96.0±0.83%、95.6±2.85%。可以看出，直接打印和优化打印在打印后体外培养的初始时段差别不大，但随着时间的推移，定制化的结构更有利于细胞活性的维持。同时，本研究比较了优化打印定制化的po250和po350的细胞活性结果，可以看出PS大小对细胞存活率存在一定影响，大的孔隙更有利于细胞的存活。

图16 优化控制前后细胞存活率的对比分析。(a)po250；(b)po350Fig.16 Comparison of cell viability in the scaffold structures after interactive analysis.(a)po250; (b)po350

3 讨论

本团队之前的研究证实了利用OCT定量表征反馈指导水凝胶精准打印的可行性[17]，本研究进一步证实基于OCT精准打印细胞负载水凝胶类组织的可行性。细胞负载在水凝胶内对打印和成像都提出了挑战，成像需要尽量避免对打印类组织活性的影响。OCT可以在非接触正常培养条件下对打印类组织直接成像，成像深度可以达到2 mm，与打印类组织的厚度匹配，分辨率可以达到10 μm，具有传统成像方式无法比拟的优势[19-20]，且3D OCT图像自动定量分析可以方便地获得打印内组织不同层面的信息和整体的立体结构信息(见图6～9)。

打印时既要控制结构稳定也需要保持细胞活性，以往的研究和本团队积累的打印工艺经验可以较好地平衡打印结构稳定和细胞活性要求[21]，但依然无法做到精准打印出预设的类组织特性，结构对打印类组织的细胞表达、组织形成和功能重建的影响难以预估，从而无法将三维打印结构控制的优势发挥到极致。本研究对细胞负载水凝胶类组织的精准打印进行尝试，实验证实包括两次闭环的反馈代优化就可以有效地将打印类组织的结构特征控制在期望值附近。

第一次闭环属于实验组，用于测试打印系统的稳定性和可控性，需要将可能的结构特征变化尽量涵盖，PS是打印结构特征的基本变量，对打印结构的其他几何参数具有较大的连带效应，同时对类组织细胞动态和功能重建影响较大，第一次实验组的PS选择从300～800 μm连续变化，涵盖组织工程常用的PS，也考虑到细胞活性和增殖对PS的要求。第二次闭环属于生产组，其打印参数设置需要根据第一次的打印缺陷分析进行优化，水凝胶浓度、打印气压、喷头设计、打印喷头温度、平台温度、打印速度和细胞密度等因素对打印结构完整性和细胞活性具有联动效果，系统全面的打印工艺优化有利于第二次类组织生产制备的成功，本团队在大量水凝胶打印制备实验中积累了打印工艺经验[22-23]。

从OCT成像结果(见图6～9)可以看出，打印类组织平均PS低于400 μm时制备的可控性较低，更容易出现孔堵塞等打印缺陷。这种打印可控性降低的问题在其他文献中也有报道，主要受限于水凝胶材料本身的溶胀特性，无论是国外的商用生物三维打印机Bioplotter(Envisiontec, Germany)，还是研究机构自制的实验室生物三维打印机，都能观测到打印可控性与预设的平均PS有关。例如，Billiet等[11]发现，即使打印参数做过最优配置，当预设PS低于600 μm时，甲基丙烯酰胺修饰明胶的浓度若低于10%(W/V)支架会发生整体坍塌，若浓度低于20%(W/V)会引起局部坍塌；能够打印出互相连通的通道结构的实际PS在500 μm左右，过大的PS并不利于细胞间的信号传递和组织形成。本研究通过迭代的优化打印方法可以将预设PS的实际打印值控制在300 μm附近。250～350 μm的PS更有利于类组织养料、废物的运输以及细胞自身的迁移活动，也有利于类组织内部血管形成[24]。

除了打印过程的影响，预设类组织的几何结构特征也会影响打印后细胞的活性表达。从直接打印组和优化组的细胞活性对比分析可以看出(见图16)，在打印参数最优化配置的情况下，直接打印和优化打印类组织的初始细胞活性并没有显著差异，而在打印后体外培养7、14 d优化打印的优势凸显，证实了打印结构精准匹配预设的重要性。由图16的细胞活性显微图可以看出，随时间推移，优化打印po250的细胞增殖可能完全覆盖本身联通的通道，相比而言优化打印po350的搭桥联通通道现象较少，这从侧面证实了预设打印对细胞功能表达、组织结构和功能重建的重要性。

尽管本研究提出的优化打印方法有利于制备出定制特性的多孔细胞负载水凝胶类组织，但仍然存在一定的限制。目前的预设打印结构是均匀结构，结构特征分析基于同一样品所有成像范围的统计分析，对于非均质结构的精准打印优化，需要通过局部单元核的量化反馈进行分析，前面提到3D标记的自动量化表征算法可以处理非均质结构的量化表征难题，进一步的研究将会试验非均质结构精准打印方案。

4 结论

本研究提出了基于OCT的细胞负载水凝胶类组织精准优化打印方法。三维OCT图像数据分析表明，细胞负载水凝胶类组织的结构参数在设计与打印结果间有较大差异；不同批次的数据证实该生物三维打印技术的稳定性；根据表征图像量化分析的结果，获得实际打印物的PS、VP、SA和PV与设计PS间的相关经验公式，基于迭代分析反馈指导第二次打印，得到满足设计要求的形态结构。

该反馈精准优化打印方法能够精准控制生物三维打印制品，结合OCT技术的发展，为组织工程支架优化设计、生物三维打印过程控制、生物三维打印组织工程与再生医学应用等提供具有潜力的精准化工具。