镉低积累青菜品种筛选及硫对镉胁迫下青菜镉含量和品质影响

2018-09-03杜小平康靖全吕金印

农业环境科学学报 2018年8期

杜小平，康靖全，吕金印

（西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨凌 712100）

近年来，随着我国工业化、城镇化快速发展，以及对化肥、污水灌溉和采矿活动的过度依赖，农业土壤重金属污染日趋严重[1]。据统计，人类活动每年向土壤排放镉（Cd）9.9～45.0万t[2]。我国受重金属污染的耕地面积近2000万hm2，约占耕地面积的1/5，其中Cd污染耕地占1.33万hm2，涉及11个省25个地区[3]。重金属可以在土壤中和作物体内积累，通过食物链进入人体，对人体健康造成潜在的威胁[4]。减少Cd进入食物链的可能途径：一是调节土壤中Cd的生物有效性；二是利用或培育吸Cd量少或Cd优先吸附在非可食部分的植物品种。Cd低积累作物品种[Low Cd accu⁃mulating cultivars（LCACs）]要求生长在Cd污染土壤中作物可食部分Cd积累量低于食品安全国家标准（GB 2762—2012），而选育Cd低积累作物品种是建立在同一物种不同品系对Cd吸收和迁移的遗传稳定差异上。研究表明，已根据一些主要农作物可食部分Cd积累量筛选出Cd低积累品种，如水稻（Oryza sativa L.）[5-8]、小麦（Triticum aestivum L.）[9-10]、玉米（Zea mays L.）[11]和白菜（Brassica perkinensis L.）[12]等，尤其是杜兰小麦，作为第一种成功选育的商业化Cd低积累农作物，已在加拿大种植很多年[13]。目前更多的研究主要集中在农作物上，但对蔬菜的研究报道较少，尤其是特别容易遭受土壤Cd污染的叶类蔬菜[14]。

硫是植物生长仅次于氮、磷、钾的第四要素，并在逆境应答中起着重要作用[15-16]。大量研究证实，硫在植物抵抗Cd毒害的过程中起着重要的作用。衣纯真等[17]研究表明，施用K2SO4能显著减少水稻对Cd的吸收，降低水稻叶、茎、谷壳以及糙米中的Cd含量。梁泰帅等[15]研究发现外施Na2SO4能明显促进小白菜生长和光合作用，减少Cd从根部向地上部转运，从而降低小白菜地上部Cd含量。由此可见，外施硫能够增强植物对Cd胁迫的抗性或耐受性。

青菜（Brassica chinensis L.）又称小白菜，是十字花科芸薹属植物，作为我国一种重要的叶类蔬菜，在南北方广泛栽培和食用[15，18]。Arthur等[19]根据作物体内Cd的积累量认为：十字花科是Cd高积累作物。李博文等[20]和张晓晴等[21]研究认为菜花、莴苣和小白菜等为重金属中度积累性。故筛选、种植重金属低积累青菜品种有助于降低长期食用青菜所带来的健康风险。本研究通过人工模拟土壤污染采用盆栽和大田小区试验，以36个不同基因型青菜品种为试验材料，根据可食部分生物量变化和Cd积累量差异，筛选出Cd高积累和Cd低积累青菜品种，并通过外施硫在大田小区进一步降低可食部分Cd含量，以期为确保食物安全及提高蔬菜营养品质提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 盆栽试验

1.1.1 供试青菜品种

青菜（Brassica chinensis L.）品种共36种，均购自相关作物种业研究所。供试青菜名称及其提供商见表1。

1.1.2 供试土壤

供试土壤取自陕西关中地区大田耕作层土（0～20 cm），土壤类型为土垫旱耕人为土（关中塿土），基本理化性质为：pH 8.02，有机质12.57 g·kg-1，速效氮、速效磷、速效钾分别为 64.29、19.58、78.62 mg·kg-1，全硫138.42 mg·kg-1，有效硫 7.24 mg·kg-1，总 Cd 0.13 mg·kg-1。

1.1.3 试验设计

盆栽试验在西北农林科技大学试验基地进行。将供试土壤均匀摊开，风干后过5 mm筛，装入聚乙烯塑料盆（18 cm×15 cm）中，每盆装土2.5 kg。Cd试剂为CdCl2·2.5H2O。以溶液形式均匀喷洒施入Cd溶液。共设3个Cd处理水平（0、1、5 mg·kg-1）模拟Cd污染土壤，分别编号为CK、Cd1、Cd5。每个处理水平设置3次重复。装盆前每千克干土施尿素0.324 g，磷酸二氢钾1.25 g，氯化钾0.158 g。搅拌均匀，平衡60 d。挑选籽粒饱满的青菜种子播种，每盆播种10粒，待植株生长至3片真叶间苗至5株。生长35 d后收集全部植株，测定各项生理指标。

1.2 小区试验

1.2.1 供试青菜品种

供试品种为盆栽筛选获得2个Cd低积累品种紫罗兰（ZLL）和矮脚黄（AJH），及2个Cd高积累品种壶瓶长梗白（HPCGB）和抗热605（KR605）。

表1 供试青菜品种及来源Table 1 Tested cultivars of pakchoi and their providers

1.2.2 小区试验设计

试验地点及供试土壤同1.1.2。在大田模拟Cd污染土壤，设置5个处理水平（试验因素与水平见表2），每个处理水平为一个小区（长×宽×深，1.2 m×1.0 m×0.25 m），利用泡沫板和塑料布对每个小区做防渗漏处理，每个小区装土150 kg，以溶液形式均匀喷洒施入CdCl2·2.5H2O和Na2SO4，与土壤搅拌均匀，平衡60 d。每个小区播种4个品种，生长35 d后收集全部植株，测定各项生理指标。

表2 试验因素与水平Table 2 Experimental factors and levels

1.3 测定项目和方法

1.3.1 生物量测定

取植株样，用自来水反复冲洗，最后用去离子水洗净，滤纸吸干多余水分。105℃杀青15 min，于80℃烘干至恒重，测定干物质量。

1.3.2 重金属Cd含量测定

将青菜样品研磨并过100目筛，称取0.5 g青菜样品可食部分，加入10 mL混合酸HNO3-HClO4（4∶1，V/V），220℃沙浴消解至透明色，采用火焰原子吸收分光光度计（Z-2000赛曼，日立公司）测定Cd含量。土壤风干后机械粉碎，过100目筛，称取2.0 g土壤样品于锥形瓶中，加入少许去离子水湿润，然后加入15 mL HNO3，于电热板上缓慢加热分解，并加以回流，蒸至近干；稍冷后加入HNO3-HClO4（4∶1，V/V）10 mL，220℃沙浴消解，蒸至近干；稍冷却后反复加入10 mL HNO3，待样品蒸至近灰白色，定容至25 mL，上清液用火焰原子吸收分光光度计测定土壤Cd含量。

1.3.3 品质指标测定

选取青菜植株从第1片展开叶向下数的第4片成熟功能叶作为材料，进行品质指标测定：可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝法[22]；可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法[22]；硝酸盐含量采用GB 5009.33—2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》[23]第三法紫外分光光度法测定；维生素C含量采用2，6-二氯靛酚比色法[24]。

1.4 Cd低积累品种（LCACs）筛选标准

研究Cd在不同品种间积累差异，综合考虑农产品产量和质量。根据以往的文献和前期的研究结果[18，25-26]，本试验中Cd低积累品种筛选标准应符合以下两个指标。一是Cd低积累品种可食部分的Cd含量不应超过食品安全国家标准最大限量值（GB 2762—2012），即青菜可食部分Cd含量最大限度为0.2 mg·kg-1。中国蔬菜地土壤Cd污染实地调查数据和土壤环境质量标准（GB 15618—1995）表明，“低等Cd污染土壤”Cd浓度范围为0.3～0.6 mg·kg-1，“中等Cd污染土壤”Cd浓度范围为0.6～1 mg·kg-1，“高Cd污染土壤”Cd浓度超过1 mg·kg-1。二是在污染土壤条件下，Cd低积累品种具有一定耐受性，其地上部分生物量不会呈现明显下降。

1.5 分析指标

选用Cd胁迫下青菜生物量响应（Biomass re⁃sponse to stress，BRS）作为评价指标[18，25，27]，青菜的耐性特征：

式中：B5和Bck分别代表5 mg·kg-1Cd和对照条件下青菜可食部分生物量。

1.6 数据处理与分析

采用OriginPro 2016软件进行图形处理，SPSS 20.0进行方差分析，通过最小显著法（LSD）检验差异显著性水平（p＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 Cd胁迫下青菜生物量变化

Cd处理下不同基因型青菜可食部分生物量存在显著差异（p＜0.01）（表3）。在CK、Cd1、Cd5处理下，36个青菜品种可食部分生物量分别为0.385～1.984、0.549～1.420、0.392～1.277 g·株-1DW，每株可食部分生物量均值分别为1.005±0.296、0.916±0.215、0.782±0.233 g DW。根据双因素方差分析，青菜可食部分生物量受青菜品种（p＜0.01）、土壤Cd浓度（p＜0.01）及两者交互作用（p＜0.01）的显著影响（表3）。

表3 Cd胁迫下36个青菜品种可食部分生物量及Cd含量Table 3 Edible parts biomass and Cd contents of 36 pakchoi cultivars under Cd stress

以Cd胁迫下青菜生物量的响应（BRS）作为评价指标（图1）。36个青菜品种的BRS指标数值在-62.5%～96.4%，与对照CK相比，Cd5处理下，22个青菜品种（59.5%）可食部分生物量呈现显著下降，对Cd胁迫表现敏感，5个青菜品种地上部分生物量呈现显著性增加，9个品种（25%）生物量差异不显著，包括WYM、LX、TCSH、SZQ、DYHDT、ZLL、LZX、SHQ和 AJH（图1）。表明36个青菜品种对Cd的耐受性差异明显，Cd胁迫抑制绝大部分青菜品种的生长。

2.2 Cd胁迫下青菜可食部分Cd积累

图1 Cd胁迫下36种青菜品种可食部分生物量响应Figure 1 Edible parts biomass response to stress（BRS）of 36 pakchoi cultivars

在CK、Cd1和Cd5处理下，不同青菜品种可食部分Cd含量差异显著（p＜0.05）。36个青菜品种CK、Cd1、Cd5处理下可食部分Cd含量分别为0.011～0.125、0.144～0.559 mg·kg-1FW 和 0.337～1.242 mg·kg-1FW，均值分别为 0.044±0.032、0.292±0.107、0.741±0.251 mg·kg-1FW（表3）。

由图2可知，对照组36个青菜品种可食部分Cd含量均低于食品安全国家标准GB 2762—2012（Cd＜0.2 mg·kg-1FW）。1 mg·kg-1Cd处理时，有8个青菜品种可食部分 Cd含量低于0.2 mg·kg-1，包括：SJXBC、ZLL、HBC、AJH、ZYHYD、SZQ、SYB和LYM。然而，当Cd浓度为5 mg·kg-1时，36个青菜品种可食部分Cd含量均超过食品安全国家标准，在该污染条件下，36个待测品种均不符合Cd低积累品种（LCACs）。表明Cd低积累品种虽然在低Cd污染土壤中可食部分Cd含量低于食品安全国家标准，但在高Cd污染土壤条件下却超过食品安全国家标准。

2.3 Cd低积累品种的筛选

在Cd1和Cd5处理下，不同青菜品种可食部分Cd含量呈现显著正相关（P=0.000 3）（图3）。根据生物量响应胁迫指数和Cd含量综合评测，在Cd1胁迫下，36个待测青菜品种中8个品种可食部分Cd含量低于食品安全国家标准，表明这8个品种符合Cd低积累品种（LCACs）第一条筛选标准。但在Cd5处理下，5个青菜品种SYB、HBC、SJXBC、ZYHYD和LYM呈现较强敏感性，其可食部分生物量显著下降，分别降低36.53%、22.45%、43.04%、48.70%和 35.66%，表明仅有3个青菜品种ZLL、AJH和SZQ符合两条筛选指标。在Cd5胁迫下，ZLL、AJH和SZQ可食部分Cd含量分别为食品安全国家标准（0.2 mg·kg-1）的1.89、2.45倍和4.9倍，因此，选择ZLL和AJH为Cd低积累青菜品种。

图3 Cd1和Cd5处理下36种青菜品种可食部分Cd含量相关性Figure 3 Correlation of Cd contents in edible parts of 36 pakchoi cultivars between Cd1 and Cd5 treatments

在所有待测36个青菜品种中，壶瓶长梗白（HPC⁃GB）和抗热605（KR605）具有较高的可食部分Cd积累量，将其作为典型Cd高积累青菜品种，与2个筛选的Cd低积累品种紫罗兰（ZLL）和矮脚黄（AJH）在大田小区条件下，探究外施硫对青菜可食部分Cd含量和蔬菜品质的影响。

2.4 硫对Cd污染土壤中青菜可食部分Cd含量的影响

图2 不同浓度Cd胁迫对36个青菜品种可食部分Cd含量的影响Figure 2 The Cd contents of 36 pakchoi cultivars in edible parts under different Cd treatments

表4 外施硫对Cd胁迫下青菜可食部分Cd含量的影响（mg·kg-1FW）Table 4 Effects of exogenous sulfur on the Cd contents in edible parts of pakchoi under Cd stress（mg·kg-1FW）

表4结果表明，两组不同积累型青菜品种可食部分Cd含量随着Cd处理水平的增加呈现显著升高趋势。2个Cd低积累品种紫罗兰（ZLL）和矮脚黄（AJH）可食部分Cd含量在Cd1、Cd5、Cd1+S50和Cd5+S50处理下均显著低于2个Cd高积累品种壶瓶长梗白（HPCGB）和抗热605（KR605），且随着Cd处理浓度增加两组不同积累型青菜品种间差异显著增加。与单一Cd处理相比，外施硫降低了可食部分Cd含量。Cd5处理下，外施硫对青菜品种壶瓶长梗白（HPC⁃GB）、抗热605（KR605）和矮脚黄（AJH）可食部分Cd含量分别显著降低33.33%、37.84%和27.54%，而其他处理下对可食部分Cd含量降低幅度均不显著。Cd1处理下，仅有Cd低积累品种紫罗兰（ZLL）和矮脚黄（AJH）可食部分Cd含量低于食品安全国家标准GB 2762—2012（Cd＜0.2 mg·kg-1），说明在一定污染条件下，Cd低积累品种种植符合食品安全。

2.5 硫对Cd污染土壤中青菜品质指标的影响

由图4可知，随着Cd处理水平的增加，Cd高积累品种壶瓶长梗白（HPCGB）和抗热605（KR605）可食部分可溶性蛋白和可溶性糖含量均呈增加趋势，Cd低积累品种紫罗兰（ZLL）和矮脚黄（AJH）呈先升后降趋势。与CK相比，Cd5处理下，壶瓶长梗白（HPCGB）可食部分可溶性蛋白和可溶性糖含量分别显著增加39.23%和34.64%，抗热605（KR605）可食部分可溶性糖含量增加了38.22%，而紫罗兰（ZLL）和矮脚黄（AJH）可食部分在Cd1处理水平下，可溶性蛋白含量分别显著增加37.65%和39.47%，可溶性糖含量分别显著增加34.71%和38.88%，而其他处理水平下含量变化不明显。外施硫不同程度提高Cd胁迫下青菜可食部分可溶性蛋白和可溶性糖含量，在Cd5处理水平下，外施硫将紫罗兰（ZLL）和矮脚黄（AJH）可溶性糖含量分别提高21.76%和19.99%，差异显著。而其余处理水平下，外施硫对4种青菜可食部分可溶性蛋白和可溶性糖的影响差异均不显著。

对照CK条件下，青菜可食部分硝酸盐含量均低于国家标准叶菜类硝酸盐含量≤3000 mg·kg-1FW（GB 18406.1—2001）。与CK相比，Cd胁迫显著增加了4个青菜品种可食部分硝酸盐含量（图4），Cd5处理下，壶瓶长梗白（HPCGB）和抗热605（KR605）可食部分硝酸盐含量显著增加了29.55%和36.54%，紫罗兰（ZLL）和矮脚黄（AJH）可食部分硝酸盐含量显著增加了62.41%和50.72%，均超过食品安全国家标准叶菜类硝酸盐限量标准；Cd1处理浓度下，抗热605（KR605）和矮脚黄（AJH）可食部分硝酸盐含量显著增加了31.19%和11.81%，超过国家标准叶菜类硝酸盐限量标准，而紫罗兰（ZLL）可食部分硝酸盐含量显著增加了21.27%，但未超标。与单一Cd处理相比，外施硫降低青菜可食部分硝酸盐含量，且均低于食品安全国家标准叶菜类硝酸盐含量。在Cd1处理条件下，ZLL可食部分硝酸盐含量降幅最高，达到41.30%。

与CK相比，Cd胁迫显著增加了壶瓶长梗白（HPCGB）和矮脚黄（AJH）可食部分维生素C含量，而抗热605（KR605）和紫罗兰（ZLL）可食部分维生素C含量呈现降低趋势。Cd5处理水平下，壶瓶长梗白（HPCGB）可食部分维生素C含量增加了38.61%，抗热605（KR605）可食部分维生素C含量降低了34.94%，差异显著。外施硫增加了可食部分维生素C含量，Cd5处理水平下，抗热605（KR605）可食部分维生素C含量显著提高了51.92%，Cd1处理下，外施硫对青菜可食部分维生素C含量影响不明显。

3 讨论

图4 外施硫对Cd胁迫下青菜可食部分可溶性蛋白、可溶性糖、硝酸盐和维生素C含量的影响Figure 4 Effects of exogenous sulfur on the contents of soluble protein，soluble sugar，nitrate and vitamin in edible parts of pakchoi under Cd stress

Cd可以通过根系进入植物体内，过量积累对植物生长和食品安全造成不利影响，严重威胁人类健康[28-29]。筛选和培育重金属低积累作物品种被认为是一种应对土壤重金属污染的有效和合理的途径。Liu等[30]和Wang等[31]对Cd低积累大白菜品种筛选时提出，Cd胁迫生物量耐受性应该作为Cd低积累品种鉴定指标之一；Wang等[32]指出植物对Cd污染具有一定抗性，产量降低和植物毒害症状不能及时和有效反映叶类蔬菜Cd污染，易于造成食品安全风险。本研究表明，不同Cd处理水平下36个青菜品种间可食部分生物量达到极显著差异。与CK处理相比，Cd5处理水平下，59.5%的青菜品种可食部分生物量降低趋势显著，25%的青菜品种生物量对Cd胁迫表现不敏感。青菜品种易受到重金属Cd污染，可食部分Cd含量不应超过食品安全国家标准GB 2766—2012（Cd＜0.2 mg·kg-1）。在Cd1处理水平下，77.78%的青菜品种可食部分Cd含量超过食品安全国家标准，Cd5处理下，所有青菜品种可食部分Cd含量均超过0.2 mg·kg-1。本研究筛选出来的2个Cd低积累品种紫罗兰（ZLL）和矮脚黄（AJH），与对照CK相比，可食部分生物量在Cd1和Cd5处理水平下差异均不显著，可食部分Cd含量在Cd1处理下低于0.2 mg·kg-1，Cd5处理水平下分别超过国家标准1.89倍和2.45倍。表明Cd胁迫对大多数青菜品种生长具有抑制作用，随着Cd处理水平的增加，青菜品种可食部分Cd含量急剧增加，Cd低积累品种在Cd中低污染（Cd＜1 mg·kg-1）条件下种植符合食品安全国家标准。

城郊作为无公害蔬菜生产基地，由于工业“三废”和农用化学物质排放，土壤极易受到各种污染，造成蔬菜重金属含量超标和品质降低。硫是植物必需的6种大量元素之一，在植物体内的含量为3%～5%，是含硫氨基酸Met（甲硫氨酸）和Cys（半胱氨酸）、GSH（谷胱甘肽）和PCs（植物络合素）等重要组成成分，广泛参与植物体内各种代谢酶促反应，缓解重金属对植物的毒害作用，提高蔬菜品质[33]。潘瑶等[34]研究发现施硫能显著降低水稻根系中Cd向地上部分转移，地上部分Cd积累量更容易受到施硫水平影响。梁泰帅等[15]研究发现外施50 mg·kg-1硫能显著降低小白菜地上部Cd含量，同时显著增加小白菜叶片可溶性蛋白、可溶性糖和抗坏血酸含量。本研究中，外施硫降低了青菜可食部分的Cd含量，Cd5处理下，壶瓶长梗白（HPCGB）、抗热605（KR605）和矮脚黄（AJH）可食部分Cd含量分别显著降低了33.33%、37.84%和27.54%，可能原因，一是土壤中硫通过改变自身形态与重金属发生反应，影响土壤重金属的生物有效性[35-36]；二是植物体中的硫代谢产物GSH在谷胱甘肽巯基转移酶（GST）的作用下与进入细胞内的Cd2+形成复合物，维持细胞内离子平衡[37]。同时GSH作为植物螯合肽PCs的合成底物，参与PCs合成，低分子量的PCs与Cd2+形成复合物Cd-PCs，可通过液泡膜转运体进入液泡，与液泡中的硫化物形成高分子状态的Cd-PC-S复合物，固定更多的Cd在液泡中[38]；三是硫对Cd根部向地上部运输具有拮抗作用[15]。外施硫能改善Cd胁迫下青菜品质，提高青菜产品中可溶性蛋白、可溶性糖和维生素C含量，降低硝酸盐含量。这与前人在大蒜[39-40]、玉米[41]和大豆[42]上的研究结果一致。本研究中，Cd5处理浓度下，外施硫提高青菜可食部分可溶性蛋白、可溶性糖和维生素C含量，其中2个Cd低积累品种紫罗兰（ZLL）和矮脚黄（AJH）可食部分可溶性糖含量分别显著增加21.76%和19.99%，Cd高积累品种抗热605（KR605）可食部分维生素C含量显著提高了51.92%。可能是镉硫交互处理增加了青菜体内非蛋白巯基、谷胱甘肽和络合素以及抗坏血酸-谷胱甘肽循环关键酶的活性，从而增强青菜对Cd胁迫的耐受性，提高了青菜营养品质[43-44]。另外，外施硫能在一定程度上降低青菜可食部分硝酸盐含量。可能是植物的氮硫代谢具有相互偶联的关系[45-46]，适量的外施硫能提高植株氮代谢限速关键酶NR（硝酸还原酶）活性和氮素同化效率，促进代谢过程，降低硝酸盐的积累[47]，同时外施硫能够提高PSⅡ电子传递能力和羧化反应速率，从而促进光合碳同化，在碳骨架和能量供应上间接拉动了氮代谢的还原同化[48]；另一方面蔬菜是喜硝植物，虽然能吸收形态，但以态为多，硫元素进入土壤后，在微生物的作用下，硫与氧发生反应产生，根据植物根部吸收养分离子交换原理，可能由于具有与竞争置换，缓解蔬菜根部嗜好性过量吸收的作用，并加速蔬菜体内的生理生化过程，促进体内的转化，减少滞留时间和累积[49]。