Gene Xpert MTB/RIF检测早期诊断结核性脑膜炎

金慧芳 刘 鑫

内蒙古自治区第四医院 1)内六科 2)胸外科，内蒙古 呼和浩特 010080

结核病是目前人类已知的单一致死性最高的传染性疾病。我国是2015年世界上新发结核病数量第三大的国家，也是全球13个同时位列结核病、结核病和HIV双重感染以及MDR-TB领域中的高负担国家之一[1-3]。中枢神经系统结核是由结核分枝杆菌引起的肺外结核中最严重的类型，占所有结核病例的5%～10%[4]。在中枢神经系统结核中，结核性脑膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是最常见的类型。TBM不仅发病率高，而且病死率可达15%～30%，是最为常见且最为严重的肺外结核病之一[5]。TBM的早期诊断治疗与其预后密切相关。除脑脊液常规、生化检查外，TBM的实验室诊断还包括脑脊液结核杆菌快速培养、结核抗体的检测以及实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)等[6]。随着医疗检测设备的不断发展和完善，Gene Xpert MTB/RIF开始出现在TBM的检测中。作为临床新兴的检测方法，其可为TBM的早期诊断提供可靠的依据[7]。本研究主要评估Gene Xpert MTB/RIF检测技术在TBM早期诊断中的价值。

1 资料与方法

1．1一般资料选择2015-10—2017-03在内蒙古第四医院住院治疗的脑膜炎患者。结脑组86例，男34例，女52例；年龄11～67(35.42±11.65)岁；均符合TBM诊断标准[8]：有密切的结核病接触史或脑外结核病史，发病缓慢，有结核毒性症状，有颅内高压、脑膜刺激征及其他神经系统症状、体征，脑脊液实验室检查符合非化脓性脑膜炎表现，排除其他细菌、病毒及HIV等引起的中枢神经系统感染和其他复合病因，且抗结核治疗有效。非结脑组32例，男20例，女12例；年龄18～72(41.54±16.35)岁；参照人民卫生出版社第6版《神经病学》[9]中的标准进行确诊，包括病毒性脑膜炎、化脓性脑膜炎等。所有病例通过临床治疗转归并综合各项检查结果后最终确诊。

1．2方法

1．2．1 标本留取：所有患者入院后在严格无菌操作下行腰椎穿刺术，并留取脑脊液约6 mL送检验科分别行抗酸染色涂片、结核分枝杆菌培养、实时荧光定量PCR(FQ-PCR)以及Gene Xpert MTB/RIF检测。

1．2．2 抗酸染色涂片检测、结核菌培养及FQ-PCR检测：按照《结核病实验室标准化操作与网络建设》[10]的要求进行相应检测和结果判定。

1．2．3 Gene Xpert MTB/RIF检测：按照Gene Xpert MTB/RIF检测系统仪器使用说明书进行操作(美国Cepheid公司)，检测结果自动判读。MTB检测等级分为阴性(未检出)、极低、低、中等、高；耐药检测分为利福平耐药、利福平敏感、不确定(即利福平耐药结果无法判读)。

2 结果

2．1不同方法对结核性脑膜炎患者脑脊液标本的检测结果结脑组86例，脑脊液Gene Xpert MTB/RIF结果显示60例阳性，26例阴性；FQ-PCR结果显示56例阳性，30例阴性；抗酸染色涂片6例阳性，80例阴性；结核分枝杆菌培养17例阳性，69例阴性。非结脑组32例，除1例脑脊液FQ-PCR阳性外，其余脑脊液Gene Xpert MTB/RIF、抗酸染色涂片及结核分枝杆菌培养均为阴性。见表1。

2．2 4种不同检测方法结果比较以临床诊断或排除结脑并经治疗后随诊证实为TBM或非结脑为标准，脑脊液Gene Xpert MTB/RIF检测的敏感度、特异性、符合率、阳行预测值及阴性预测值分别为69.8%(60/86)、100%(32/32)、77.9%(92/118)、100%(60/60)、55.2%(32/58)，符合率高于其他3种检测技术，与抗酸染色涂片及结核分枝杆菌培养比较差异有统计学意义(P<0.05)；诊断一致性评价中，脑脊液Gene Xpert MTB/RIF检测的Kappa=0.792，P<0.01。见表3。

表1 结脑组与非结脑组不同方法的检测结果Table 1 Results of different methods in the two groups

表2 不同检测方法对结核性脑膜炎的诊断试验评价 (%)Table 2 Diagnostic test evaluation of different detection methods for tuberculous meningitis

表3 诊断试验的一致性检验Table 3 Consistency test of diagnostic test

3 讨论

TBM是由结核杆菌侵犯蛛网膜下腔引起的一种最常见的中枢神经系统结核病。不论是儿童还是成人，TBM都是肺外结核最严重的表现形式，是致残、致死的最主要原因之一。近年来，随着多耐药结核分枝杆菌的流行、免疫抑制剂的广泛应用以及人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的增加，全球结核病发病率明显上升，TBM也逐年增多[11，25-26]。TBM不仅起病缓慢、早期临床表现无明显特异性、脑脊液载菌量低且病原微生物检出率不高、时间长以及病理学诊断不易获得，使得TBM的确诊十分困难[12，27-28]，常被误诊为病毒性或化脓性脑膜炎。临床常通过对患者的结核接触史、临床表现、头部影像学检查以及脑脊液检查等综合判断以及诊断性的抗结核治疗进行确诊，易引起误诊误治或延误治疗而造成较严重的并发症、后遗症及死亡。研究显示，早期确诊的TBM病死率<10%，而晚期确诊的TBM病死率却高达60%[13，29-30]。因此，快速、准确、特异性高的TBM早期诊断方法是改善患者预后的关键，也是临床医师迫切想要解决的问题。

2010年南非结核性脑膜炎专家共识认为，脑脊液培养、抗酸涂片或多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仍是诊断TBM的“金标准”。传统的结核菌培养不仅阳性率低且耗时较长，而BACTEC MGIT960等快速培养系统虽然具备培养时间短、阳性率高等优点，但仍有污染、假阳性以及设备昂贵等缺点。抗酸染色法虽操作简便、快速且价格低廉，但敏感性较低，易出现假阴性等情况，而改良的抗酸染色法虽提高了检测的敏感性，但因抗酸杆菌均能着色，因此菌种的区分仍不能实现。PCR等核酸扩增技术具有快速、敏感、高效等优点，对早期诊断TBM有独特的优越性，但操作过程复杂、易出现交叉污染，致使出现假阳性的情况。此外，PCR检测往往要求设备精良，在大多数基层医院无法普及。

随着检测设备及手段的不断进步，Gene Xpert MTB/RIF检测系统的问世，为结核病的早期诊断提供了快速、有效的确诊方法[14-15，31]。该技术是一种基于巢式PCR技术发展而来的基因扩增技术，能够在2 h内针对rpoB基因81 bp利福平耐药核心区间(RRDR)设计引物、探针，检测其是否发生突变，进而用于诊断结核及检测利福平耐药(rpoB序列存在突变)[16，32]。Gene Xpert MTB/RIF技术作为WHO唯一最新推荐的用于结核分枝杆菌及利福平耐药快速检测的手段，具有污染可能性小、检测样本多样、操作简单、检测周期短、敏感性高、特异度强、对实验室要求较低等特点，使其成为结合诊断方面具有里程碑意义的新方法[17，33]。Gene Xpert MTB/RIF作为肺结核及耐药肺结核诊断领域里的新技术已经得到较为广泛的应用。但关于该项技术对于肺外结核的研究相对较少，其诊断价值尚缺乏统一的认识。国内外相关研究的Meta分析显示[18-19，34]，Gene Xpert MTB/RIF检测技术在肺外结核诊断中的敏感度25.0%～96.6%，而特异度则基本保持在100%左右，说明该技术在肺外结核的诊断中同样具有较高的价值；而在胸腹腔积液、脑脊液、心包积液等不同部位的Gene Xpert MTB/RIF肺外结核检测中所得到的敏感度和特异性有较高的异质性，这就需要对这类情况进行更为深入的研究[20-21，35]。

本研究中，以临床诊断或排除结脑并经治疗后随诊证实为TBM或非结脑为标准，评价脑脊液Gene Xpert MTB/RIF检测的敏感度和特异性，结果显示，Gene Xpert MTB/RIF检测脑脊液中结核分枝杆菌的敏感度为69.8%，符合率为77.9%，除与FQ-PCR的65.1%敏感度以及73.7%的符合率差异无统计学意义外，与抗酸染色涂片及结核分枝杆菌培养的敏感度、符合率差异均有统计学意义，与相关文献报道基本一致[22-23，36]。因此，Gene Xpert Mtb/RIF技术相对于传统抗酸染色、结核分枝杆菌培养而言，不但提高了敏感度，而且最大程度缩短了检测时间，尤其对结核分枝杆菌的耐药性检测更具优势[24]。另外，FQ-PCR的检测步骤多，容易受操作相关因素的影响而导致检测结果存在一定的假阳性和假阴性，而Gene Xpert MTB/RIF操作简单、全程自动化，有效避免了上述因素的影响，因而可以更好地满足临床需求。在诊断试验的一致性检验中，Gene Xpert Mtb/RIF技术(K=0.792)高于其他抗酸染色(K=0.062)、结核分枝杆菌培养(K=0.172)以及FQ-PCR(K=0.463)，表明其具有较高的临床诊断价值。此外，本研究中检测阳性的60份脑脊液中20份含量显示为极低浓度，32份显示为低浓度，8份显示为中等浓度，未检测出高浓度的脑脊液。一方面，可能由于血脑屏障造成的相对无菌的环境，使得脑脊液中结核菌含量相对较少；另一方面，可能与本次研究未纳入合并HIV感染者有关，而入组患者的机体免疫力强，巨噬细胞对结核杆菌的吞噬消灭作用强，造成结核杆菌数量较少。因此，今后是否可以采用集菌、破膜等方法增加脑脊液中菌浓度及DNA浓度提高Gene Xpert MTB/RIF的阳性检出率，还需进一步研究验证。

Gene Xpert MTB/RIF检测法相对于抗酸染色涂片、结核分枝杆菌培养以及FQ-PCR在诊断TBM方面有更为显著的优势，能够有效帮助临床医生对疑似TBM的患者进行早期诊断，降低致残率、致死率，提高患者的生存质量。