向日葵茎芯多糖的提取工艺优化及其体外抗肿瘤活性研究

姜守刚 谭 笑 吴 磊 吴 比 袁颖洁 祖元刚*

(1.东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040； 2.生物资源生态利用国家地方联合工程实验室，哈尔滨 150040)

向日葵(HelianthusannuusL.)为菊科(Asteraceae)向日葵属(Helianthus)植物，别名望日莲、太阳花、向阳花。向日葵现于我国的东、西部地区和内蒙古等地均有广泛栽培。据文献记载，向日葵的茎、叶、籽、盘、根均有治疗疾病的作用[1]。向日葵茎芯为向日葵的茎内髓芯，又名向日葵茎髓、向日葵瓤、葵花秆心、葵秆。其化学成分主要为多糖类[2]，同时也含黄酮、酚酸、不饱和脂肪酸、萜、香豆素类等。向日葵茎芯水煎液可以明显抑制小鼠的移植瘤[3]，它还可以破坏亚硝胺，从而达到防治癌症的目的[4]。多年以来，杭州市第二人民医院利用向日葵茎芯煎液治疗胃癌的结果表明，胃癌转移的患者可以通过口服葵芯煎液来使病情得到有效的缓解[5]。据研究表明，向日葵的茎芯多糖能够增强小鼠免疫功能[6～7]。向日葵茎芯中主要的活性成分可能是多糖。

多糖广泛存在于自然界的植物体当中，包括纤维素、淀粉、果胶、多聚糖等。多糖在植物的根、茎、叶、果实等组织中含量丰富[8]。多糖具有的药理作用十分广泛，它可以参与机体的各种生理代谢活动，具有调节机体免疫功能、抑制肿瘤、抗衰老、抗氧化、抗病毒、降血脂、降血糖等多种生物活性[9～10]。近年来，国内外对向日葵茎芯多糖的研究逐步增多，而对多糖提取工艺研究却并没有太多报导，向日葵茎芯多糖的提取研究颇具价值。长期以来，多数向日葵秸秆被作为取暖的燃料，或作为饲料来饲养家畜[11]，甚至直接被废弃，造成极大的资源浪费。本文采用水提醇沉法[12～13]，以向日葵茎芯为原料，提取多糖类物质，采用单因素试验优化向日葵茎芯多糖提取条件，并在此基础上对其体外抗肿瘤活性进行研究[14]，这对向日葵资源的进一步开发利用具有重要的理论价值和实际意义。

1 材料

1.1 仪器

紫外可见分光光度计(722s)购自上海精密科学仪器有限公司。分析天平(ALC-1104)购自北京赛利多斯仪器系统有限公司。电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9240)购自上海一恒科学仪器有限公司。离心机(LG10-2.4A)购自北京京立离心机有限公司。水浴锅(B-220)购自上海亚莱生化仪器厂。旋转蒸发仪(RE52CS)购自上海亚莱生化仪器厂。CO2细胞培养箱(CP-ST200A)购自长沙长锦科技有限公司。

1.2 材料与试剂

向日葵采自中国甘肃，秋季收取，将向日葵的茎芯自然晾干，再放入40℃烘箱中干燥8 h，用粉碎机将干燥的向日葵茎芯粉碎后备用。试验所用试剂均为分析纯，测定与分析用水均为蒸馏水。无水葡萄糖标准品购自上海源叶生物科技有限公司，无水乙醇购自天津市天力化学试剂有限公司。苯酚购自天津光复精细化工研究所。氯仿购自天津市富宁精细化工有限公司。正丁醇购自天津市富宁精细化工有限公司。DMEM细胞培养液、RPMI1640培养液、胎牛血清、青霉素链霉素溶液均购自Hyclone公司。胰蛋白酶购自Gibco公司。MTT(噻唑蓝)购自Sigma公司。DMSO购自Solarbio公司。人胃癌细胞SGC-7901、人结肠癌细胞HCT-8、人类口腔上皮癌细胞KB均购自中国医学科学院基础医学研究所。紫杉醇购自浙江海正药业股份有限公司。

2 方法

2.1 向日葵茎芯多糖的提取

取一定量干燥的向日葵茎芯粉末，过筛，用95%乙醇回流提取两次，以去除脂溶性成分；再用80%乙醇回流提取两次，以除去单糖和低聚糖[15]。所得残渣烘干，挥发去除有机溶剂后，按照一定的提取次数、原料颗粒大小(目数)、料液比、提取时间、提取温度，使用热水浸提，待提取液冷却后，对其进行过滤并收集滤液。将滤液减压浓缩至一定体积后加入95%乙醇，使溶液中乙醇含量达80%，静置24 h，3 000 r·min-1离心15 min，将所得沉淀烘干，即得到向日葵茎芯粗多糖样品[16～17]。

2.2 向日葵茎芯多糖含量的测定

2.2.1 多糖含量标准曲线

采用苯酚—硫酸比色法测定多糖含量，具体操作如下：以0.1 mg·mL-1无水葡萄糖为标准品。在8个10 mL的容量瓶中分别精密吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mL的葡萄糖标准溶液。分别加入1.0 mL 5%苯酚溶液，再将5.0 mL浓硫酸直接滴到溶液表面，摇匀，沸水浴加热15 min，冷却20 min后定容，于选定的490 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，多糖浓度为横坐标，绘制标准曲线[16～17]。

2.2.2 多糖含量的测定

取方法2.1所得粗多糖样品，用蒸馏水溶解后得到样品溶液。精密吸取样品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，按2.2.1多糖含量标准曲线项下的方法操作，于选定的490 nm波长处测定吸光度。将吸光度的数值代入上述的标准曲线方程中即可计算出样品中的多糖浓度[16～17]。

2.3 向日葵茎芯多糖提取的单因素试验

选择提取次数、原料颗粒的大小(目数)、料液比(W/V)、提取时间、提取温度作为5个单因素，考察各因素对向日葵茎芯多糖含量的影响，每组试验重复3次。

2.3.1 提取次数对向日葵茎芯多糖含量的影响

准确称取一定量干燥的向日葵茎芯粉末，过60～80目筛，按料液比1∶50加入蒸馏水，90℃下分别浸煮提取1、2、3、4和5次，每次时间均为3.0 h。

2.3.2原料颗粒的大小(目数)对向日葵茎芯多糖含量的影响

准确称取一定量干燥的向日葵茎芯粉末，过标准样筛的目数范围分别为20～40、40～60、60～80、80～100以及大于100目，按料液比1∶50加入蒸馏水，90℃下分别浸煮提取2次，每次时间均为3.0 h。

2.3.3 料液比对向日葵茎芯多糖含量的影响

准确称取一定量干燥的向日葵茎芯粉末，过60～80目筛，分别按料液比(g·mL-1)为1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60加入蒸馏水，90℃下浸煮提取2次，每次时间均为3.0 h。

2.3.4 提取时间对向日葵茎芯多糖含量的影响

准确称取一定量干燥的向日葵茎芯粉末，过60～80目筛，按料液比1∶50加入蒸馏水，90℃下浸煮提取2次，每次提取时间分别为2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 h。

2.3.5 提取温度对向日葵茎芯多糖含量的影响

准确称取一定量干燥的向日葵茎芯粉末，过60～80目筛，按料液比1∶50加入蒸馏水，分别于60、70、80、90和100℃下浸煮提取2次，每次时间均为3.0 h。按照2.2.2中的方法测定多糖含量。

2.4 向日葵茎芯多糖的体外抗肿瘤活性研究

采用MTT法对向日葵茎芯多糖的体外抗肿瘤活性进行检测。人类胃癌细胞SGC-7901、人类结肠癌细胞HCT-8、人类口腔上皮样癌细胞KB均为贴壁细胞，用RPMI1640或DMEM培养液(89%基础培养液、10%胎牛血清、1%青霉素链霉素溶液)培养。将100 μL的肿瘤细胞(1×104个/mL)分别铺板至96孔板中，24 h后，分别加入空白培养基和向日葵茎芯多糖，各药物分为8个浓度，即1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0 mg·mL-1。药物的每一浓度设4个复孔。同时阳性对照组为分别加入不同浓度的紫杉醇，阴性对照组不加药物只加等浓度的DMSO；空白对照组只加细胞。加药后，分别培养72 h，终止培养，每孔加入MTT溶液(5 mg·mL-1)10 μL，37℃，继续孵育4 h。小心吸弃孔内上清液，之后每孔加入100 μL DMSO，十字交叉混匀，用酶标仪570 nm波长处测定吸光值(OD值)。

取每4个重复孔OD值的平均数，计算细胞抑制率：

以细胞抑制率为纵坐标，多糖浓度为横坐标，绘制细胞的生长抑制曲线，并采用Bliss法计算药物对细胞的半数抑制浓度(IC50)。试验重复3次。数据以平均值±标准差表示[15]。

3 结果与分析

3.1 多糖含量标准曲线的绘制

按照2.2.1的方法，以吸光度作为纵坐标，多糖浓度(mg·mL-1)为横坐标，绘制多糖含量标准曲线(图1)。将试验数据处理得回归方程：y=80.996x+0.009 1，其中R2=0.998 9。根据此标准曲线，可以测定向日葵茎芯多糖样品中的多糖浓度，并计算出多糖的含量。

图1 多糖标准曲线Fig.1 Standard curve of polysaccharide

3.2 向日葵茎芯多糖提取的单因素试验

3.2.1 提取次数对向日葵茎芯多糖含量的影响

当浸煮提取次数为2次时，多糖的含量较提取次数仅为1次时有所提高，随着提取次数的增加，多糖的含量基本无明显变化(图2A)。综合考虑节约时间和提取效率等因素，选择2次为向日葵茎芯多糖最佳提取次数。

3.2.2原料颗粒的大小(目数)对向日葵茎芯多糖含量的影响

随着目数的增加，向日葵茎芯多糖的含量逐步升高，由此可见原料直径越小，表明细胞表面的破裂程度越大，其内部的多糖越容易被提取出来(图2B)。经试验表明颗粒大小为60～80目的多糖含量与80目以上相差不大。因此选择原料颗粒大小60～80目为向日葵茎芯多糖最佳提取目数。

3.2.3 料液比对向日葵茎芯多糖含量的影响

当料液比低于1∶50时，多糖的含量会随料液比的增大而有所提高，当料液比高于1∶50时，多糖含量变化并不明显(图2C)。当料液比较小时，多糖不能够提取完全；料液比过大时，后期过滤、回收、转移较困难，会造成浪费。因此选择1∶50为向日葵茎芯多糖最佳提取料液比。

3.2.4 提取时间对向日葵茎芯多糖含量的影响

当提取时间低于3.0 h时，多糖的含量会随提取时间的延长而有所提高，当提取时间高于3.0 h时，多糖含量基本不随时间的延长而增高(图2D)。由此可知，应选择3.0 h为向日葵茎芯多糖的最佳提取时间。

3.2.5 提取温度对向日葵茎芯多糖含量的影响

多糖的含量随着温度的升高而有所提高(图2E)。但温度达到90℃以上后含量几乎无变化。分析认为，温度较低时，多糖浸提不充分；而过高的温度会对多糖的结构有所破坏，且会影响多糖的生物活性。因此选择90℃为向日葵茎芯多糖最佳提取温度。

图2 向日葵茎芯多糖提取的单因素试验结果Fig.2 Results of the single factor test of polysaccharides extraction from Helianthus annuus L.

由单因素试验结果可知，最佳提取条件为：提取次数为2次，原料颗粒的大小(目数)为60～80目，料液比为1∶50，提取时间为3.0 h，提取温度为90℃，在该条件下，向日葵茎芯多糖的提取得率为6.56%，多糖的含量为266.03 mg·g-1。

3.3 向日葵茎芯多糖的体外抗肿瘤活性研究

紫杉醇浓度分别为0.018±0.002、0.003±0.001和0.002±0.001 mg·mL-1时，对人胃癌细胞SGC-7901、人结肠癌细胞HCT-8和人类口腔上皮癌细胞KB的生长抑制率为50%(图3)。向日葵茎芯多糖对人胃癌细胞SGC-7901、人结肠癌细胞HCT-8和人类口腔上皮癌细胞KB的生长均有抑制作用，且抑制率均会随多糖浓度的增加而增加。当向日葵茎芯多糖浓度分别为4.201±0.083、5.843±0.069和3.016±0.078 mg·mL-1时，对人胃癌细胞SGC-7901、人结肠癌细胞HCT-8和人类口腔上皮癌细胞KB的生长抑制率可达50%。表明向日葵茎芯多糖的体外抗肿瘤活性较弱，其抗肿瘤活性有待进一步研究。

图3 多糖对三种细胞作用的浓度—抑制率曲线Fig.3 The concentration-inhibition rate curve of polysaccharides exerted proliferation inhibitory activity to three tumor cell lines

4 讨论

多糖具有广泛的药理作用，其在抗肿瘤、抗衰老、降血糖等方面都有独特的生理活性且具有无毒、副作用小的优点[18～19]。近年来，随着多糖研究的深入，向日葵多糖的抗肿瘤活性也逐步成为热点之一。向日葵资源十分丰富，其茎芯里含有丰富的多糖，之前常作为燃料、饲料或直接被丢弃而造成极大的资源浪费。因此，对向日葵茎芯多糖的提取具有重要意义。优化向日葵茎芯多糖的提取工艺，提高其多糖含量，对其大量提取生物活性物质并开展生物活性的研究具有重大意义。

水提醇沉法因操作简便，设备成本较低，能够显著的提高药液澄明度等优点，应用十分普遍[20]。影响向日葵茎芯多糖提取的因素主要有提取次数、原料颗粒的大小(目数)、料液比、提取时间、提取温度，通过单因素试验确定了最佳提取条件为：提取次数为2次，原料颗粒的大小(目数)为60～80目，料液比为1∶50，提取时间为3.0 h，提取温度为90℃，在该条件下，向日葵茎芯多糖的提取得率为6.56%，多糖的含量为266.03 mg·g-1。单因素试验优化了向日葵茎芯多糖的提取条件，有助于提高向日葵茎芯多糖的含量，对向日葵茎芯多糖的开发利用有重要意义。

研究结果表明，当向日葵茎芯多糖浓度分别为4.201±0.083、5.843±0.069和3.016±0.078 mg·mL-1时，对人胃癌细胞SGC-7901、人结肠癌细胞HCT-8和人类口腔上皮癌细胞KB的生长抑制率可达50%，表明向日葵茎芯多糖的体外抗肿瘤活性较弱，可对其进行更深入的研究和利用。