长白落叶松无性系抗寒性比较研究

郑 密 赵国辉 孙晓阳 张秦徽 赵 昕 董利虎 李凤日 赵曦阳*

(1.林木遗传育种国家重点实验室，林学院，东北林业大学，哈尔滨 150040； 2.吉林四平林木种子园，四平 136000)

长白落叶松(Larixolgensis)属松科(Pinaceae)落叶松属(LarixSpp.)是我国东北和内蒙古林区重要的生态树种[1]。其具有树干通直、木材优良及生长迅速等优点，是东北地区重要的用材、造纸及森林更新的重要树种[2]。我国对落叶松遗传改良已经将近50年，研究方向主要从种源选择[3]到种子园营建[4]以及分子标记辅助育种[5]等。

温度是影响植物生长和分布的重要因子，低温直接影响植物的生长和生理代谢[6]。低温胁迫时间的长短也是影响植物发育的重要因素，随着胁迫时间的延长，植物损伤越重[7]。低温胁迫会对细胞膜构成伤害，导致细胞膜通透性的改变，细胞内大量的物质向外渗透[8]，从而引起相对电导率的变化，因此，利用相对电导率可以测定植物的抗寒性低温胁迫下，植株相对电导率越大，抗寒性越差[9]。抗寒性是林木遗传改良的一个重要性状，直接影响着其分布和改良，是抗逆性育种中一个重要的性状。自Dexter首次利用低温下相对电导率的变化来测定植物抗寒性以来，电导率法已成为抗寒性测定的最常用的方法之一[10]，目前有很多关于测定电导率预测抗寒性的报导，都取得了理想的效果[11]。本研究以四平市林木种子园长白落叶松58个无性系1年生枝条为试验材料，对其进行低温胁迫处理，利用电导率对各无性系进行聚类分析，比较不同无性系的抗寒性强弱，以期为长白落叶松抗寒无性系评价选择提供理论基础。

1 试验材料和方法

1.1 试验地点及材料

试验地点位于吉林省四平市林木种子园(东经124°10′、北纬43°05′)，该地点属于中温带湿润季风气候，海拔高度在330 m，土壤为黑棕土，年均降水量572.8 mm，年平均温度5.9℃，年均无霜期142 d，年均日照2840 h。试验材料包括58个28年生长白落叶松无性系(L1、L3、L5、L7、L11、L13、L14、L16、L17、L19、L20、L21、L23、L24、L25、L27、L28、L30、L31、L32、L33、L36、L38、L40、L42、L44、L46、L48、L49、L50、L51、L52、L53、L55、L56、L58、L59、L61、L62、L63、L64、L65、L67、L71、L73、L74、L77、L78、L79、L87、L88、L90、L91、L92、L96、L97、L99、L101)。

1.2 试验方法

于2016年11月初(室外温度-10～0℃)采集各无性系的1年生枝条，采用完全随机试验设计，每个无性系随机选取15株长势相近的树，在每个单株的中上部南侧挑选长势相近、粗细均匀的当年生枝条进行取样(每个单株取样10个长约10厘米的枝条，每个无性系各150个枝条进行混合)，蜡封后用保鲜带装好后带回实验室，先用自来水冲洗，再用去离子水冲洗两遍，用滤纸吸干后放入4℃冰箱保存待用。

1.2.1 时间与温度耦合试验

以L1、L36、L59和L90等四个无性系为材料，各无性系的枝条随机分成16个处理组和1个对照组，每组6次重复。无性系枝条在室温(20℃)放置1 h后，测其室温相对电导率对照组。处理组各无性系枝条分别放入-50℃、-40℃、-30℃和-20℃低温冰箱中，每个温度下分别处理6、8、10和12 h，共16个处理。处理后将每个处理的枝条拿出放入4℃冰箱恢复1 h，测定其处理相对电导率。

1.2.258个无性系常温及低温胁迫下电导率测定试验

首先根据1.2.1的方法测定58个无性系的对照相对电导率，之后将58个无性系的枝条放入-40℃低温冰箱中，处理12 h，拿出放入4℃冰箱恢复1 h后，测定其处理相对电导率。

1.2.3 相对电导率测定方法

将低温胁迫处理后的枝条剪成0.2～0.3 cm的小段，避开芽眼，混合均匀，称取1 g置于15 mL长试管中，加入10 mL去离子水，盖上塞子，置于室温下12 h，重复3次，之后用DDS-307A数字电导仪测定其初始电导率(D1)，然后盖上塞子，将试管放入沸水中水浴30 min，取出后冷却至室温，再测定其最终电导率(D2)，利用D1与D2的比值计算枝条相对电导率。

1.2.4 统计分析方法

所有数据利用SPSS和EXCELL软件进行分析。其中4个无性系温度与时间处理方差分析采用线性模型为：

Xijkl=μ+Ai+Bj+Ck+ABij+ACik+BCjk+ABCijk+eijkl

(1)

式中：μ为总体平均值；Ai为无性系效应；Bj为温度效应；Ck为时间效应；ABij为无性系与温度交互效应；ACik为无性系与时间的交互效应；BCjk为温度与时间的交互效应；ABCijk为无性系、时间与温度之间的交互作用；eijkl为环境误差。

58个无性系之间方差分析采用线性模型为：

Xij=μ+Ai+eij

(2)

式中：μ为总体平均值；Ai为无性系效应；eij为环境误差[12]。

根据续九如[12]的方法估算无性系重复力：

R=1-1/F

(3)

式中：F为方差分析的F值。

2 结果和分析

2.1 不同时间及温度处理条件下4个无性系的相对电导率方差分析

4个无性系(L1、L36、L59和L90)处理组相对电导率数据反正弦转换处理后进行方差分析，结果见表1，所有变异来源的相对电导率差异均达极显著水平(P<0.01)。

表1不同温度和时间处理下4个无性系相对电导率的方差分析

Table1ANOVAanalysisofrelativeelectrolyticleakageof4clonesunderdifferenttemperatureandtimetreatment

性状TraitsSSdfMSF无性系Clone0.16530.055515.775**温度Temperature0.71730.2392242.357**时间Time0.14730.049459.487**无性系×温度Clone×Temperature0.06990.00871.627**无性系×时间Clone×Time0.01190.00111.296**温度×时间Temperature×Time0.04790.00549.478**无性系×温度×时间Clone×Temperature×Time0.051270.00217.773**误差Error0.0141280.000总计In all58.403191

注：**代表方差分析检验差异达极显著水平(P<0.01)。

Note:**indicated significant level of ANOVA test.

2.2 不同温度和时间处理下4个无性系相对电导率值

在相同的胁迫时间下，随着温度的降低，各无性系处理相对电导率均逐渐升高(表2)；在同一温度胁迫下，随着胁迫时间的延长，各无性系处理相对电导率的变化趋势不尽相同。在-20℃低温胁迫下，随着时间的延长(6～12 h)，各无性系处理相对电导率均呈现逐步升高的趋势，表明在该温度条件下，低温胁迫时间越长，对细胞膜造成的伤害越大；而在-30℃和-40℃的低温胁迫下，虽然各无性系相对电导率总体仍是增大的趋势，但部分无性系(-30℃下无性系L36，-40℃下无性系L59和L90)表现出在处理相对电导率增大的过程中出现小幅度减小的规律；当温度降低到-50℃时，在胁迫时间8～10 h，无性系L36、L59和L90的处理相对电导率在上升后均出现了急剧的下降，只有无性系L1的处理相对电导率未出现下降，反而随胁迫时间延长逐渐上升。

2.3 室温及低温胁迫下各无性系相对电导率方差分析

利用T检验分析室温和处理条件下58个无性系相对电导率，结果表明差异达显著水平(P<0.05)，进一步对58个无性系间室温和低温胁迫后所测的相对电导率进行方差分析(表3)，在室温和处理下，无性系间的相对电导率均存在极显著的差异。从重复力来看，室温和处理条件下，无性系电导率重复力均较高，分别达到0.95和0.98。

表2不同温度和时间处理下各无性系的处理相对电导率

Table2Averagerelativeelectrolyticleakageofdifferentcloneunderdifferenttemperatureandtimetreatment

温度Temperature无性系Clone时间Time处理电导率Average conductivity-50℃L1L36L59L90653.00±2.54c861.92±0.06b1064.20±0.84ab1267.00±1.87a658.67±1.41c875.81±1.75a1072.09±1.13b1276.41±1.21a663.47±1.51d882.17±0.49a1072.43±4.56c1279.06±1.68a659.94±1.39c871.31±0.27b1061.57±1.27c1275.05±0.28a-40℃L1L36L59L90653.07±0.14c857.32±1.24b1057.84±0.33b1262.28±0.24a660.25±0.70c860.35±0.97c1073.01±2.05b1276.04±1.40a657.42±0.78c862.43±0.30b1059.42±0.56bc1267.87±0.17a658.66±1.21a859.95±0.88a1055.62±0.43b1259.71±1.52a-30℃L1L36L59L90644.11±0.82b845.31±0.37ab1046.29±0.28a1248.41±2.58a656.13±1.20b852.44±0.99c1056.50±0.46b1265.94±0.58a653.60±1.29c854.47±0.25bc1057.28±1.17b1260.78±0.74a651.14±0.72c855.40±1.39ab1056.62±0.26a1258.57±1.45a-20℃L1L36L59L90642.01±0.26b842.34±0.50ab1045.20±0.37a1246.70±0.41a646.36±1.38b847.20±1.82b1048.06±0.40b1251.19±1.28a648.66±0.86b850.74±0.90ab1052.25±1.62a1252.77±0.94a644.97±0.65c846.10±0.33c1049.59±0.71b1252.70±1.26a室温条件下Under indoor temperatureL1—27.51±6.76L36—29.00±1.63L59—29.49±0.82L90—34.31±1.46

表3室温及低温胁迫下无性系间电导率方差分析

Table3ANOVAofconductivityamonydifferentcloneunderindoororlowtemperaturestress

电导率Conductivity变异来源Variance sourceSSdfMSFR室温条件下Under indoor temperature 无性系Clone4561.845780.0319.53**0.95低温胁迫下Under Low temperature stress无性系Clone13323.7557233.7543.44**0.98

2.4 室温及处理条件下各无性系相对电导率均值

各无性系室温和-40℃处理条件下的平均相对电导率见表4，低温胁迫下各无性系相对电导率总体均值为61.51%，为室温条件下(28.58%)的2.15倍；在室温和低温胁迫下，相对电导率最大的无性系均为L55，其值分别为37.89%和76.58%，比总体平均值分别高32.58%和24.50%，比最小值L40(16.79%和38.73%)分别高125.67%和97.73%；不同无性系在低温胁迫下和室温的平均相对电导率差值大小变化也不同，其中无性系L36的差值最大(47.04%)为最小的为无性系L40(21.95%)的2.14倍。

表4 室温及低温胁迫下各无性系相对电导率均值

注：均值单位为%，下同。

Note:The unit of average relative conductivity were %,the same as below.

2.5 聚类分析

以低温(-40℃、12 h)和室温条件下各无性系相对电导率的差值为指标进行聚类分析，采用欧氏距离聚类法，在遗传距离为8左右时，58个无性系被聚为3类(图1)。第一类为L1、L3、L7等37个无性系，第二类为L5、L16、L21等9个无性系，第三类为L25、L30、L36等13个无性系。三类无性系相对电导率差值的总体均值分别为32.53%、26.16%和38.73%，低温(-40℃、12 h)胁迫下三类无性系的相对电导率总体均值分别为60.42%、49.75%和72.68%，室温条件下三类无性系的相对电导率总体均值分别为27.89%、23.59%和33.95%。相比第一类和第三类无性系而言，第二类无性系在室温和-40℃、12 h处理下的相对电导率均较低，表明其抵抗低温胁迫的能力较其他无性系强。

图1 各无性系相对电导率差值聚类分析Fig.1 Cluster analysis of the difference of relative electrolytic leakage of different clone

3 讨论

植物相对电导率的大小能反映其细胞膜受损的程度，可以作为抗寒性强弱的测定指标[13～14]。不同温度和时间处理下，各无性系间相对电导率存在极显著差异，且随着低温胁迫时间的延长或温度的降低，各无性系相对电导率均呈现逐渐增大趋势，表明细胞膜损伤加剧，这与乌凤章[15]等对黑松(PinusthunbergiiParl.)和龚月桦等[16]对奥地利黑松(Pinusnigravar.austriaca)、花旗松(Pseudotsugamenziesiivar.glauca)的研究结果类似。在-30℃和-40℃的低温胁迫下，虽然各无性系相对电导率总体仍是增大的趋势，但部分无性系(-30℃下无性系L36，-40℃下无性系L59和L90)表现出在相对电导率增大的过程中出现小幅度减小的规律，表明其呈现不同程度的自我修复能力，部分无性系相对电导率在增长过程中会出现先降低再增长的现象，这可能与细胞的自我修复能力以及这种能力不足以抵抗低温胁迫对细胞膜造成的损伤有关[17]，具体的生理代谢机制有待于今后的进一步研究。在不同低温持续胁迫下，各无性系相对电导率随着温度降低逐渐增大，当温度降低到-40℃，持续10 h低温胁迫处理时，绝大部分无性系相对电导率出现降低趋势，再一次体现细胞膜的自我恢复能力，但当时间持续到12 h时，相对电导率逐渐上升。在-40℃、12 h处理下，各无性系的相对电导率变化范围在59.71%～76.04%，相比室温和其他处理而言，更接近半致死温度下的相对电导率[18]，因此以-40℃、12 h处理对58个无性系进行胁迫试验。

抗寒性较强的无性系，其细胞膜受损程度低，自我修复能力强，而抗寒性差的无性系，其细胞膜面对低温胁迫时，自我修复能力差，细胞膜破坏严重[19]。本研究中利用相同低温胁迫(-40℃、12 h)条件处理不同无性系，结果表明低温胁迫下不同无性系之间相对电导率呈极显著差异水平，说明不同基因型具有不同的抗寒性，进一步表明对不同无性系进行评价选择具有重要意义。聚类分析是基于距离和样品间的相似度，将研究对象按多个方面的特征进行综合分类的一种统计方法[20]。本研究中根据各无性系在-40℃、12 h处理和室温条件下相对电导率差值，运用欧氏距离聚类分析法，在欧氏距离为8左右时，将各无性系聚为三类，其中第二类无性系(L5、L16、L21、L23、L27、L40、L73、L78和L90)相对电导率差值较小，在-40℃、12 h低温胁迫下的总体平均相对电导率为49.75%，其抗寒性较强，可作为抗寒性育种中优良无性系的选择材料。尤其无性系L90，在室温条件下电导率较高，但处理后电导率上升较小，表现较强的预抗性及抗寒性[21]。

随着林木育种进程的推进以及不同育种目标的需求，林木抗寒性性状的选择仍具有重要的育种意义[22]。本研究中对58个无性系进行持续低温胁迫处理和聚类分析，初步筛选出抗寒性较强的9个无性系(L5、L16、L21、L23、L27、L40、L73、L78和L90)，这对于长白落叶松抗寒性研究和优良无性系综合评价选择具有重要意义，为今后长白落叶松抗逆性育种研究提供理论基础。