核因子κB受体活化因子配体对血管紧张素Ⅱ诱导人肾小球足细胞分泌血管内皮细胞生长因子的影响

齐悦 朱涛 覃志成

[摘要]目的 觀察核因子κB受体活化因子配体（RANKL）对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的人肾足细胞分泌血管内皮细胞生长因子（VEGF）的影响，探究AngⅡ是否通过RANK/RANKL信号通路影响足细胞表达VEGF。方法 以分化为树枝状的人肾足细胞为研究对象，以不同浓度（0、1、10、100 nmol/L）的AngⅡ处理，分别于不同时间（0、6、12、24 h）通过实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测基因VEGF、RANK和RANKL的mRNA表达变化。然后以不同剂量的RANKL与100 nmol/L AngⅡ共同刺激足细胞24 h后，通过RT-PCR检测VEGF的mRNA表达变化，流式细胞术检测足细胞凋亡率变化。结果 AngⅡ呈剂量和时间依赖性地诱导足细胞表达VEGF、RANK和RANKL（P<0.05），而过量RANKL表现出剂量依赖性地阻断VEGF表达增高 （P<0.05）；与对照组比较，AngⅡ可以显著诱导足细胞凋亡（P<0.05），而RANKL可以抑制由AngⅡ诱导的足细胞凋亡（P<0.05）。结论 AngⅡ可能通过RANK/RANKL信号通路影响足细胞表达VEGF，RANKL通过反馈调节下调VEGF基因表达来抑制AngⅡ引起的足细胞凋亡，保护肾脏。

[关键词]足细胞；血管紧张素Ⅱ；核因子κB受体活化因子配体；血管内皮细胞生长因子

[中图分类号] R692.6 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）5（b）-0013-05

Effect of receptor activator of nuclear factor-κB ligand on the secretion of vascular endothelial cell growth factor from human glomerular podocytes induced by angiotensinⅡ

QI Yue1 ZHU Tao2 QIN Zhi-cheng3

The Second Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

[Abstract]Objective To investigate the effect of receptor activator of nuclear factor-κB ligand （RANKL） on the secretion of vascular endothelial growth factor （VEGF） induced by angiotensin Ⅱ （AngⅡ） in human renal podocytes，and to explore whether AngⅡaffecting VEGF expression in podocytes through RANK/RANKL signaling pathway.Methods The human renal podocytes differentiated into dendrites were selected as research subjects.They were dealt with AngⅡin different concentrations （0，1，10，100 nmol/L）.Real-time fluorescence quantitative PCR was performed at different time （0，6，12，24 h） to detect the changes in mRNA expression of the genes VEGF，RANK，and RANKL.Then podocytes were stimulated with different doses of RANKL and 100 nmol/LM AngⅡ for 24 h.The expression of VEGF mRNA was detected by RT-PCR and the apoptosis rate of podocytes was detected by flow cytometry.Results AngⅡ induced podocyte expression of VEGF，RANK，and RANKL in a dose-and time-dependent manner （P<0.05），while excess RANKL showed dose-dependent blockade of VEGF expression increasing （P<0.05）.Compared with the control group，AngⅡ significantly induced podocyte apoptosis （P<0.05），while RANKL inhibited podocyte apoptosis induced by AngⅡ （P<0.05）.Conclusion AngⅡ may affect podocyte expression of VEGF through RANK/RANKL signaling pathway.RANKL inhibits the apoptosis of the podocytes induced by AngⅡ by regulating the expression of VEGF gene through feedback regulation and protects the kidneys.

[Key words]Podocyte；Angiotensin Ⅱ；Receptor activator of nuclear factor-κB ligand；Vascular endothelial growth factor

足细胞（肾小球脏层上皮细胞，podocyte）作为肾小球的滤过屏障的重要组成部分，在多种因素的刺激下可导致其损伤，从而引起蛋白尿的发生和肾小球的硬化[1]。血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ），作为肾脏局部肾系血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）的主要效应因子， 在间充质干细胞、小鼠和人足细胞等多种细胞中能诱导血管内皮细胞生长因子（VEGF）表达上调，p-38、Akt、ERK可能发挥着重要作用[2-5]。但AngⅡ与VEGF在人足细胞中的作用机制仍有许多不明之处还需进一步研究。

Liu等[6]的研究发现一条和炎症相关的新信号通路介导足细胞损伤，即肿瘤坏死因子家族的核因子κB受体活化因子（receptor activator for nuclear factor-κB，RANK）信号，RNAK的配体（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）可以阻抑凋亡，保护足细胞。前期实验已发现AngⅡ可以通过p38MAPK信号通路诱导足细胞表达VEGF[7]，推测在人肾小球足细胞中是否也存在类似AngⅡ-RANK/RANKL-VEGF的通路，调节足细胞的功能，故本实验拟对AngⅡ诱导足细胞表达VEGF的变化及其与RANK/RANKL信号通路的关系进行研究，以进一步明确AngⅡ诱导足细胞表达VEGF的作用机制及其对足细胞的保护作用，为将来药物干预提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

RPMI-1640培养基（美国GIBCO公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；1% ITS（胰岛素10 μg/ml、转铁蛋白5.5 μg/ml、亚硒酸钠5 ng/ml，美国Sigma公司）；青霉素（华北制药）；AngⅡ （美国Sigma公司）；RANKL（美国R&D; Systems公司）； Trizol液（美国Promega公司）；引物 （上海生工公司）；RNA 提取试剂盒 （美国Omega公司）；反转录试剂盒（Prie Script TMRT-PCR kit，宝生物工程有限公司）；SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（宝生物工程有限公司）；实时荧光定量PCR仪（瑞士Roche公司）。

1.2 足细胞培养

人肾小球足细胞由英国Bristol大学Saleem教授赠送，按参考文献[8]的方法培养。足细胞复苏后在含1% ITS的RPMI-1640培养液（10%胎牛血清）中，于33℃ 、5%CO2培养箱中培养，用含0.05%胰蛋白酶的消化液消化传代，然后转入37℃、5%CO2培养箱分化14 d。选取在37℃条件下分化为树枝状的人肾足细胞为研究对象。

1.3实验分组

AngⅡ浓度梯度对人肾小球足细胞表达基因VEGF、RANK和RANKL的影响：细胞各组中分别加入AngⅡ，其终浓度分别为0、1、10、100 nmol/L，培养24 h后收集细胞。AngⅡ时间梯度对人足细胞VEGF、RANK和RANKL基因表达的影响：用100 nmol/L AngⅡ影响VEGF基因表达的最佳浓度干预细胞，分别培养0、6、12、24 h。RANKL对AngⅡ诱导人肾小球足细胞表达VEGF的影响：用AngⅡ（100 nmol/L）加入不同剂量的RANKL（0、20、40、80 ng/ml）干预足细胞24 h，同时设置正常组（不加AngⅡ和RANKL）。

1.4 RNA提取和半定量RT-PCR

用Trizol法提取总RNA进行RT-PCR检测，以GAPDH作为内参基因，采用2-ΔΔCT法进行相对定量。严格按照RT-PCR相关试剂盒说明书进行操作，提取RNA，逆转录成cDNA，用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒在Roche 480仪器上进行PCR检测。PCR反应条件为：95℃ 30 s，95℃ 10 s，60 ℃ 20 s（35 cycles）。各基因引物序列见表1。

1.5 AngⅡ和 RANKL干预对足细胞凋亡率的影响

实验分三组：分别以100 nmol/L 的AngⅡ单独刺激足细胞，100 nmol/L的AngⅡ和80 ng/ml的 RANKL共同处理足细胞24 h，同时设置空白对照组。胰酶消化收集细胞，PBS洗涤细胞2次，使用凋亡检测试剂盒進行FITC和PI双染15 min，30 min内通过流式细胞仪测定细胞凋亡情况。

1.6 统计学分析

采用SPSS 16.0软件分析数据，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析（one-way AVONA）和Turkey检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同剂量AngⅡ对人肾足细胞VEGF、RANK和RANKL mRNA表达水平的影响

RT-PCR检测结果显示，以不同浓度AngⅡ刺激肾足细胞24 h后，VEGF、RANK和RANKL mRNA表达均呈剂量依赖性升高。如图1所示，与空白组比较，较大剂量组（10、100 nmol/L AngⅡ）的VEGF、RANK和RANKL mRNA表达量明显上升，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 AngⅡ刺激不同时间对人肾足细胞VEGF、RANK和RANKL mRNA表达水平的影响

在AngⅡ（100 nmol/L）刺激肾足细胞0、6、12、24 h后，VEGF、RANK和RANKL mRNA表达均呈时间依赖性升高。与对照组（0 h）比较， VEGF、RANK和RANKL mRNA表达量均随干预时间增加而呈现明显的上升趋势（P<0.05）（图2）。

2.3 RANKL对经AngⅡ诱导的足细胞表达VEGF的影响

与空白组比较，经AngⅡ 100 nmol/L刺激，不添加RANKL的对照组的VEGF mRNA表达增加（P<0.01）。经RANKL干预的足细胞，VEGF mRNA的表达受到抑制，且呈现剂量依赖性抑制。小剂量组（20 ng/ml）与对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。但随着RANKL剂量的增大，VEGF mRNA表达明显下调（P<0.05）（图3），提示在AngⅡ诱导的足细胞中，RANKL影响mRNA的表达，与VEGF mRNA的表达成负相关。

2.4 AngⅡ和 RANKL干预对足细胞凋亡率的影响

收集细胞，使用BD Accuri C6流式细胞仪进行细胞凋亡率检测，并进行方差分析。与空白组（0.4±0.1）%比较，对照组（AngⅡ 100 nmol/L）的凋亡率为（28.34±2.2）%，说明AngⅡ可以明显诱导足细胞凋亡。AngⅡ+RANKL组的细胞凋亡率为（11.14±1.06）%，与AngⅡ比较，差异有统计学意义（P<0.05）（图4），提示RANKL可以抑制AngⅡ诱导的足细胞凋亡。

3 讨论

蛋白尿是几乎所有肾小球疾病的共同临床表现之一，它不仅是肾小球滤过屏障受损的标志，而且它与肾小球疾病的进展密切相关，是肾小球疾病进展的独立危险因素。足细胞是附着在肾小球基底膜（GBM）外侧高度分化的细胞[9]，作为肾小球固有细胞之一，连同GBM和毛细血管内皮细胞一起，构成肾小球血液滤过屏障[10]。作为血液滤过的最后屏障，足细胞已经成为针对蛋白尿研究的关键细胞。目前大量研究认为，足细胞损伤是肾小球损伤的中心环节，可以直接导致蛋白尿的发生及肾小球的硬化。因此，研究足细胞从而揭示蛋白尿发生的机制具有重要意义。

VEGF是一种二聚体糖蛋白，是内皮特异性的有丝分裂原，在肾脏主要表达于足细胞的足突，有增加血管通透性、促进内皮细胞增生和血管形成作用。而VEGF受体则以跨膜蛋白的形式表达于肾小球内皮细胞表面，足细胞可以通过旁表达的方式调节内皮功能，是内皮细胞重要的调控因子[11]。肾小球足细胞和内皮细胞是构成滤过膜的重要成分，VEGF能减少GBM阴离子数而影响电荷屏障，并通过影响肾小球内皮细胞而调节机械屏障，因而VEGF被认为是调节肾小球通透性的重要因子，在肾病进展中扮演着重要的角色[12]。大量证据表明，VEGF与蛋白尿的形成密切相关[13]，VEGF的异常表达增加可导致肾小球滤过膜通透性增加，促进蛋白尿的形成。

肾脏局部的RAS在慢性肾脏病变的发生发展中的重要作用越来越受到人们的关注，RAS的主要效应因子AngⅡ 与许多肾脏疾病的发展过程密切相关[14-15]。研究表明，AngⅡ可以诱导肾脏内生性VEGF的产生[5]。此外，Ren等[16]的研究发现，AngⅡ以剂量依赖方式诱导培养的足细胞以及动物模型足细胞凋亡。本研究也发现，AngⅡ可以诱导足细胞凋亡，但是过量的RANKL会抑制AngⅡ诱导的足细胞凋亡。足细胞作为血液滤过的最后屏障，其凋亡必然会增加肾小球滤过膜的通透性，引起蛋白尿的形成。因此，维持VEGF正常水平和足细胞的数量，可以保护肾小球，避免蛋白尿的发生。

RANK及其RANKL是肿瘤坏死因子（TNF）及其受体超家族的成员。以往对RANK和RANKL的研究主要集中在骨质疏松及骨肿瘤性疾病中。大多数学者认为RANK/RANKL/OPG通路是成骨细胞和破骨细胞之间进行对话的重要信号通路， RANKL结合RANK后通过调控NF-κB和MAPK通路促进破骨细胞的分化与活化引起骨质的破坏[17]。近年有研究表明，RANK和RANKL参与慢性肾脏疾病的发生与发展。Liu等[6，18]在肾小球硬化性肾病、IgA肾病、膜性肾病等患者肾脏中发现RANK和RANKL的高表达，且RANK特异性表达于足细胞。Chen等[19]体内外研究发现，RANK和RANKL介导NF-κB通路和MAPK通路活化，促进足细胞损伤，加快肾脏疾病的发生与发展。

本研究发现，AngⅡ以时间和剂量依赖性的上调VEGF基因的表达，这与Pupilli等[20]的研究结果类似。此外，AngⅡ还能引起RANK和RANKL基因水平的表达上调。当足细胞中加入过量外源性的RANKL时，VEGF的基因水平表达下调，最终引起足细胞凋亡率减少。上述两方面实验结果说明，RANKL与VEGF存在直接的相互关系，处于同一个通路AngⅡ-RANK/RANKL-VEGF中。当AngⅡ含量升高，刺激足细胞表达过多的VEGF，能导致蛋白尿的发生。而AngⅡ还能引起RANK/RANKL的表达升高。但当RANKL达到一定浓度后，能下调VEGF的表达水平，形成反馈调节。因此，AngⅡ和RANK/RANKL兩者通过一定的平衡状态共同调节VEGF的表达，维持肾脏的正常功能。本文的研究提示AngⅡ和RANK/RANKL两者共同维持VEGF表达水平，避免足细胞凋亡，为将来药物干预治疗尿蛋白提供了研究基础。

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（收稿日期：2018-03-06 本文编辑：许俊琴）