美拉德反应改良四角蛤蜊酶解液的风味

李学鹏，刘晏玮，高郡焕，朱文慧，励建荣,*，张玉玉，李钰金，林 洪

四角蛤蜊（Mactra veneriformis）属蛤蜊科，是我国沿海主要的低值贝类[1]。四角蛤蜊肉质细腻，滋味鲜美，除含有蛋白质、氨基酸、脂肪酸等多种营养成分外，还富含核苷酸、糖原、有机酸等多种呈味物质，是开发海鲜调味品的理想原料。目前，我国对四角蛤蜊等低值贝类的加工一般以干制、冷冻为主，这些传统加工方法产品形式单一，且附加值低，如何实现此类低值贝类的高值化利用和精深加工成为贝类加工产业发展亟待解决的问题[2]。通过蛋白酶酶解技术可将四角蛤蜊等低值贝类制成富含氨基酸和多肽的水解物，同时兼具呈味和营养功能，是开发高附加值、功能性调味品的关键途径[3]。朱蕴菡[4]研究发现四角蛤蜊酶解物具有良好的血管紧张素转化酶抑制活性和一定的羟自由基清除能力。张开伟[5]发现四角蛤蜊酶解液中的多肽抗氧化活性显著。但现有研究主要集中在四角蛤蜊的酶解工艺和酶解液中肽的活性研究等方面，对酶解液进行风味改良以此来开发海鲜调味品的研究相对较少。美拉德反应是游离氨基酸、多肽或蛋白质的氨基与还原糖的羰基之间发生的一种复杂反应，其反应产物包括挥发性香气物质、Strecker醛类物质和大分子质量棕黑色聚合物，这些产物在食品风味的形成中起着重要作用[6]。据报道，美拉德反应中分子质量较小的交联产物可以明显提高产品的持续感和醇厚感[7]。Dunkel等[8]利用美拉德反应产物作为风味增强剂来改善食品的口感和鲜味。Yu Min等[9]发现豆粕水解液通过美拉德反应后鲜味氨基酸含量增加，苦味氨基酸含量下降，具有很好的感官特性。通常情况下，直接酶解水产蛋白质获得的水解液存在风味不良等特点，可通过美拉德反应增香技术对其进行风味改良[10-11]。此外，研究表明美拉德反应产物还具有一定的抗氧化活性[12-15]，在改良底物风味的同时可提高其营养功能。鉴于此，本研究以四角蛤蜊酶解液为原料，通过美拉德反应改良其风味，以感官评定、美拉德反应程度及色差为指标，研究还原糖的种类、复合比例与添加量、反应温度、反应时间和反应体系初始pH值对美拉德反应产物风味特性的影响，并对反应前后的酶解液中氨基酸和挥发性风味成分进行对比分析，以确定较优的美拉德反应工艺条件，为制备海鲜调味基料和开发高品质海鲜调味品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活四角蛤蜊购于锦州市林西街水产市场。

中性蛋白酶（0.8 AU/g）、复合蛋白酶（1.5 AU/g）（均为食品级） 诺维信（中国）生物技术有限公司；D-葡萄糖、乳糖（均为食品级） 阿拉丁试剂有限公司；D-木糖、果糖、蔗糖（均为食品级） 国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠（分析纯） 天津市风船化学试剂科学有限公司；盐酸（分析纯） 锦州古城化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

DK-8D电热恒温水槽 上海一恒科技有限公司；Biofuge®Stratos台式高速冷冻离心机 美国赛默飞世尔科技公司；UV-2550紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；JY-10型小型粉碎机 济南九阳有限公司；FE20-FiveEasy™ pH计、PL602-L型分析天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；DHG-9123A电热恒温鼓风干燥 上海一恒科学仪器有限公司；CR-400色差仪 柯尼卡美能达集团；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 郑州长城科工贸有限公司；7890N/5975气相色谱-质谱联用仪、1260高效液相色谱仪 美国Agilent公司；20 mL顶空钳口样品瓶、固相微萃取装置、50/30 μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取头 美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 四角蛤蜊酶解液的制备

采用实验室前期确定的复合酶酶解工艺进行制备[16]。酶解条件为：料液比1∶4（g/mL）、蛋白酶添加质量分数2.4‰、中性蛋白酶-复合蛋白酶质量比2∶1、酶解时间5.5 h、酶解温度52 ℃。酶解结束后升温至95 ℃保持15 min进行灭酶，得到四角蛤蜊酶解液。

1.3.2 美拉德反应改良四角蛤蜊酶解液风味反应条件的确定

1.3.2.1 还原糖种类对酶解液美拉德反应产物风味的影响

取40 g酶解液于50 mL的锥形瓶中，分别添加木糖、乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖（其分解产生的单糖具有还原性）1.0 g，调节pH值至7.0，100 ℃反应60 min，冷却后进行感官评定。

1.3.2.2 木糖与葡萄糖最适复合比例的确定

取40 g酶解液于50 mL的锥形瓶中，加糖1.0 g（木糖和葡萄糖添加质量比分别为2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6），调节pH值至7.0，100 ℃反应60 min，冷却后进行感官评定。

1.3.2.3 反应温度的确定

取40 g酶解液于50 mL的锥形瓶中，加糖1.0 g（木糖-葡萄糖1∶2，m/m），调节pH值至7.0，分别在80、90、100、110、120 ℃条件下反应60 min，冷却后进行感官评定。

1.3.2.4 反应时间的确定

取40 g酶解液于50 mL的锥形瓶中，加糖1.0 g（木糖-葡萄糖1∶2，m/m），调节pH值至7.0，分别在100 ℃条件下反应20、40、60、80、100、120 min，冷却后进行感官评定。

1.3.2.5 反应体系初始pH值的确定

取40 g酶解液于50 mL的锥形瓶中，加糖1.0 g（木糖-葡萄糖1∶2，m/m），分别调节pH值至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，100 ℃反应80 min，冷却后进行感官评定。

1.3.2.6 正交试验优化美拉德反应条件

在单因素试验的基础上，以感官评分为指标，选择反应时间、反应温度、反应体系初始pH值和还原糖添加量4 个因素设计正交试验，如表1所示。

表1 L9（34）正交试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels used for orthogonal array design

1.3.3 美拉德反应产物的感官评价

请6 名（3 男、3 女）受过专门训练的感官评定员组成一个感官评定小组，并对每个待评样品用3 位数字进行随机编号，评定员根据具体的感官评定标准（表2）进行打分。

表2 感官评定标准Table 2 Sensory evaluation criteria

1.3.4 美拉德反应程度的测定

1.3.4.1 低分子质量香味中间体形成程度的测定

据文献[17]报道，美拉德反应产物中的低分子质量香味中间体在波长280 nm处有特定吸收峰，吸光度可以指示其生成程度，A280nm越大越好。将经美拉德反应后的四角蛤蜊酶解液进行抽滤，滤液稀释100 倍，以超纯水为参比，在波长280 nm处测定其吸光度。

1.3.4.2 褐变程度测定

美拉德反应的最后阶段生成类黑精物质，在波长420 nm处有吸收[18]。将美拉德反应产物稀释10倍，以超纯水为参比，在420 nm波长处测定其吸光度，检测美拉德反应的褐变程度。每次实验做3 个平行，结果表示为 ±s。

1.3.5 色差的测定

将经美拉德反应后的四角蛤蜊酶解液进行抽滤，稀释10 倍，取6 mL反应液，用色差计测其L*、a*、b*值。以四角蛤蜊酶解液为对照，按下式计算其色差ΔE。每次实验做6 个平行，结果用 ±s表示[19]。

1.3.6 氨基酸含量的测定

准确称取一定量（0.5～1.0 g）的样品于水解管中，加入6 mol/L的盐酸12 mL，加入少量新蒸馏的苯酚，向管中充入高纯的氮气，马上拧紧盖子，放入110 ℃烘箱水解22 h。用去离子水定容到50 mL，取适量定容好的溶液，减压干燥至干，加少量去离子水，重复减压干燥2 次，用超纯水定容备用。采用高效液相色谱仪测定，进样前样品经OPA FMOC柱前衍生，过0.22 µm滤膜。测定条件为：Hypersil ODS C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；柱温40 ℃；流速1.0 mL/min；紫外检测器波长338、262 nm（Pro、Hypro）；流动相：A相为40 mmol/L Na2HPO4，用8 mol/L氢氧化钠溶液调pH值为7.8，B相为乙腈-甲醇-水（45∶45∶10，V/V）。梯度洗脱程序：0～17.0 min，B相0%～60%；18.0～20.0 min，B相60%～100%；23 min后B相为0%。

1.3.7 挥发性化合物的测定

样品前处理：准确称取0.5 g四角蛤蜊酶解物，用去离子水定容到50 mL，取4 mL样品于20 mL顶空瓶中，加入磁转子，迅速用聚四氟乙烯隔垫密封，60 ℃磁力搅拌加热平衡20 min后，用已老化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头顶空吸附30 min，将萃取头插入气相色谱进样口，解吸5 min。

气相色谱条件：HP-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm）；进样口温度250 ℃，不分流模式进样；载气为He，流速1.0 mL/min；不分流模式进样；程序升温：柱初温35 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升至120 ℃，保持1 min，再以6 ℃/min升至250 ℃，保持6 min。

质谱条件：电子电离源；接口温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；质量扫描范围m/z 30～550。

1.4 数据处理

采用SPSS 19.0软件进行数据方差分析和显著性检验，采用Origin 8.5软件进行数据作图。样品中挥发性成分结果分析采用峰面积归一化法计算出各挥发性化合物的相对含量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 还原糖种类对四角蛤蜊酶解液美拉德反应产物风味的影响

图1 还原糖种类对美拉德反应产物风味的影响Fig. 1 Effect of sugar type on the sensory score of MRPs

表3 还原糖种类对美拉德反应产物吸光度和色差的影响Table 3 Effect of sugar type on absorbance values and color difference

美拉德反应主要是还原糖和氨基酸之间的反应，不同还原糖的反应活性和增香效果不同。常见糖的反应活性顺序为D-木糖＞L-阿拉伯糖＞己糖（D-果糖、D-甘露糖、D-半乳糖和D-葡萄糖）＞二糖（蔗糖、乳糖、麦芽糖）[20]。本研究选择了常见的几种糖（木糖、乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖）进行美拉德反应。由图1和表3可知，糖的种类对四角蛤蜊酶解液美拉德反应产物的风味影响较大。木糖的感官评分最高，葡萄糖次之，蔗糖最差。木糖在波长280 nm和420 nm的吸光度也最高，颜色的变化也最大，即美拉德反应程度最强，蔗糖次之。由于木糖的成本较高，且美拉德反应的色泽影响较大，而葡萄糖的美拉德反应程度较低，但其反应液的色泽较好，口感也较好，所以将葡萄糖和木糖复配来进行美拉德反应。

2.1.2 还原糖复合比例对四角蛤蜊酶解液美拉德反应产物风味的影响

由图2和表4可知，当木糖与葡萄糖的添加比例为1∶2时，酶解液的感官评分结果最高，且在波长280 nm处表现为最高的的吸光度。这表明此比例下发生的美拉德反应生成了较高含量的低分子质量香味中间体，从波长420 nm处的吸光度和色差值也可以看出，此时酶解液的美拉德反应适中，色泽良好。综合考虑，选择木糖与葡萄糖添加比例1∶2为较佳的复配比例。

图2 木糖与葡糖糖添加比例对美拉德反应产物风味的影响Fig. 2 Effect of different ratios of xylose to glucose on the sensory score of MRPs

表4 木糖与葡萄糖添加比例对美拉德反应产物吸光度和色差的影响Table 4 Effect of different ratios of xylose to glucose on absorbance values and color difference

2.1.3 反应温度对四角蛤蜊酶解液美拉德反应产物风味的影响

图3 不同反应温度对美拉德反应产物风味的影响Fig. 3 Effect of reaction temperature on the sensory score of MRPs

表5 不同反应温度对美拉德反应产物吸光度和色差的影响Table 5 Effect of reaction temperature on absorbance values and color difference

美拉德反应受温度的影响很大，温度相差10 ℃，褐变速度相差3～5 倍[21]。由图3可知，在选定的温度范围内，四角蛤蜊酶解液美拉德反应产物感官评分呈现先上升后下降的趋势，当温度为100 ℃时，感官评分最高。由表5可知，随着反应温度的升高，美拉德反应程度增大，色差也增大。温度低于100 ℃，美拉德反应程度较低，产物特征香味不明显；当温度高于100 ℃时，低分子质量香味中间体含量较高，但感官评分下降，可能是因为美拉德反应程度较大，类黑精物质生成较多，掩盖了原有的海鲜风味[22-23]。因此选择100 ℃为美拉德反应温度。

2.1.4 反应时间对四角蛤蜊酶解液美拉德反应产物风味的影响

由表6可知，随着反应时间的延长，美拉德反应液在波长280 nm和420 nm处的吸光度逐渐增大，色差也逐渐增大，即美拉德反应程度逐渐增大，这与董志俭等[24]的研究结果相同。但由图4可知，随着反应时间的延长，美拉德反应液的感官评分呈现先上升后下降的趋势，反应时间过长，口感变差，分值降低。当反应时间为80 min时，感官评分最高，所以选择80 min为美拉德反应时间。

表6 反应时间对美拉德反应产物吸光度和色差的影响Table 6 Effect of reaction time on absorbance values and color difference

图4 反应时间对美拉德反应产物风味的影响Fig. 4 Effect of reaction time on the sensory score of MRPs

2.1.5 反应体系初始pH值对四角蛤蜊酶解液美拉德反应产物风味的影响

图5 反应体系初始pH值对美拉德反应产物风味的影响Fig. 5 Effect of initial pH on the sensory score of MRPs

表7 反应体系初始pH值对美拉德反应产物吸光度和色差的影响Table 7 Effect of initial pH on absorbance values and color difference

美拉德反应体系的初始pH值能够严重影响美拉德反应的进行[25-26]。由图5、表7可知，酶解液初始pH值在弱酸和弱碱性范围，美拉德反应后的感官评分均呈现一个较高点。当初始pH值为6.5时，感官评分最高。此时A280nm最大，即低分子质量香味中间体产生最多。因此选择6.5为美拉德反应的初始pH值。

2.1.6 还原糖添加量对四角蛤蜊酶解液美拉德反应产物风味的影响

图6 还原糖添加量对美拉德反应产物风味的影响Fig. 6 Effect of amount of reducing sugar on the sensory score of MRPs

表8 还原糖添加量对美拉德反应产物吸光度和色差的影响Table 8 Effects of amount of reducing sugar on absorbance values and color difference

由图6和表8可知，随着还原糖添加量的增加，美拉德反应程度增大，色差也变大，但其感官评分呈现先上升后下降的趋势。当还原糖添加量为3.5%时，感官评分最高，当还原糖添加量超过3.5%时，美拉德反应后酶解液口感偏甜，影响整体风味，感官评分下降。

2.2 正交试验结果

表9 正交试验设计及结果Table 9 Orthogonal array design with response variable

在单因素试验的基础上，选择反应体系初始pH值、反应温度、反应时间和还原糖添加量为影响因素，设计正交试验，对美拉德反应工艺进行优化。根据表9中各因素的极差大小可知，4 个因素对产品感官评分的影响顺序为反应温度（B）＞反应体系初始pH值（C）＞反应时间（A）＞还原糖添加量（D）；根据各因素间感官评分和极差分析可知，美拉德反应的最优组合为A3B2C2D3，即反应时间90 min、反应温度100 ℃、反应体系初始pH 6.5、还原糖添加量4.0%。在此条件下，与感官评分最优组合进行验证实验，优化后其感官评分为23.68±0.21，为最佳风味组合。

2.3 美拉德反应前后酶解液中氨基酸的变化

表10 美拉德反应前后酶解液中氨基酸组成和含量的变化Table 10 Changes in amino acid composition after the reaction%

氨基酸（尤其是游离氨基酸）对海鲜调味基料的呈味起着重要的作用。如表10所示，美拉德反应前的酶解液中共检测出18 种氨基酸成分，游离氨基酸总量为20.475%，氨基酸总量为53.629%。游离氨基酸中含量较高的5 种氨基酸为丙氨酸、亮氨酸、牛磺酸、精氨酸和甘氨酸，其中丙氨酸的含量最丰富，约占游离氨基酸总量的21.97%，是重要的甜味氨基酸。呈鲜味的氨基酸主要为天冬氨酸和谷氨酸，分别占游离氨基酸总量的1.49%和5.15%。组氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸为呈苦味的氨基酸，此类氨基酸约占游离氨基酸总量的27.84%。精氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、赖氨酸和脯氨酸是既带有苦味，又带有甜味，约占游离氨基酸总量的21.62%。牛磺酸约占游离氨基酸总量的9.92%，它可以增加食品体系呈味的柔和性、层次性和总体滋味[27]。

不同种类的氨基酸参与美拉德反应的难易程度不同，不同的氨基酸与葡萄糖反应会产生的香气也不同，如组氨酸反应无明显香气，蛋氨酸呈马铃薯味，异亮氨酸和亮氨酸呈温和的面包皮味，苯丙氨酸呈焦糖味，赖氨酸呈烤马铃薯味，此外，甘氨酸、丙氨酸和缬氨酸和葡萄糖与木糖都可形成酱香风味[28]。由表10可以看出，美拉德反应后，酶解液中游离氨基酸总量、总氨基酸含量和各游离氨基酸含量均有较大程度的减少，其中丙氨酸、甘氨酸、牛磺酸和谷氨酸的损失率较大，其次是组氨酸、精氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸，说明这些氨基酸可能是参与美拉德反应并对反应产物风味起主要作用的氨基酸。

2.4 美拉德反应前后酶解液中挥发性化合物的变化

图7 美拉德反应前后挥发性化合物的总离子流图Fig. 7 Total ionic chromatogram of volatile compounds before and after Maillard reaction

表11 美拉德反应前后主要挥发性化合物及其相对含量Table 11 Main volatile compounds and their relative contents before and after Maillard reaction

续表11

续表11

用固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对挥发性风味成分进行提取，测定其挥发性化合物的总离子流图如图7所示。通过谱库检索，并结合有关文献，采用峰面积归一化法计算出各化合物的相对含量，结果见表11。美拉德反应前检测出47 种挥发性风味物质，美拉德反应后检测出48 种挥发性风味物质。虽然挥发性化合物的总数相差不大，但是化合物的种类和相对含量有所差异。其中醛类、酮类和酯类物质增加，烯烃类物质降低。此外，还生成了一些酸类物质、醇类物质和酚类物质。

醛类是四角蛤蜊中种类最多、相对含量最丰富的挥发性风味物质，对其香气贡献也最大。与美拉德反应前相比，醛的种类和相对含量均有所增加。其中相对含量较高的醛类物质有苯乙醛、苯甲醛、壬醛、异戊醛、庚醛、（E）-2-辛烯醛、己醛、庚醛、十二醛、十五醛和十四醛三聚物等。这些醛类物质主要是一些分子质量较高的醛和不饱和醛。据报道，5～9 个碳原子的醛具有清香、油香、脂香风味[29]。不饱和醛大多数具有清香，令人愉悦的气味[30]。苯乙醛的相对含量最高，约为17.20%，这可能是构成肉香味的组成成分。

美拉德反应后共检测出6 种酮类物质，比美拉德反应前有所增加。其中相对含量较高的有2-壬酮、甲基壬基甲酮和2,5-辛二酮等。在贝类中发现的甲基酮（C3～C17）可能是由其碳链的β氧化，再经脱羧作用形成的，这些化合物具有明显的水果香和清香，其花香味随着碳链的增长而更加显著[31]。酯类物质的种类和相对含量也有所增加，共检测出5 种酯类物质。其中相对含量较大、对四角蛤蜊海鲜调味基料的香气起主要贡献的有草酸酰胺乙酯、甲酸庚酯和邻苯二甲酸二丁酯。一般认为这些酯类物质是通过羧酸和醇的酯化作用形成的，通常具有甜的果香，可以柔和样品的整体风味[32]。

烯烃类物质的种类和相对含量均低于美拉德反应前。从实验结果可以看出，（＋）-长叶环烯、异长叶烯、长叶烯的相对含量在美拉德反应后未检出，这可能是因为烯烃类物质易氧化和挥发，其种类和相对含量会随着反应温度的升高而减少[29]。

此外，美拉德反应后生成的酸、醇和酚类物质对酶解液风味有一定的影响[33]。但因其相对含量较少，对风味的贡献不大。

3 结 论

利用单因素试验和正交试验确定美拉德反应改良四角蛤蜊酶解液风味的工艺条件为木糖与葡萄糖比例1∶2，还原糖添加量4.0%，反应体系初始pH6.5，100 ℃反应90 min。在此条件下，酶解液风味得到了较大改善，鲜香味浓郁。美拉德反应后，酶解液中18 种氨基酸均有不同程度的损失，其中丙氨酸、甘氨酸、牛磺酸和谷氨酸的损失率较大，其次是组氨酸、精氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸，说明这些氨基酸可能是参与美拉德反应及对反应产物风味起主要作用的氨基酸。美拉德反应前后挥发性化合物的数量相差不大，种类和相对含量有所差异。其中醛类、酮类、酯类物质增加，烯烃类物质降低，此外，反应还生成了一些酸类物质、醇类物质和酚类物质。