冠心舒通胶囊对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡的影响

2018-08-31毛慧子田洪阳

锦州医科大学学报 2018年4期

毛慧子，田洪阳

(1.锦州医科大学附属第一医院心内三病区;2.锦州医科大学附属第一医院泌尿外科，辽宁锦州 121000)

急性心肌梗死早期再灌注治疗，无论是溶栓或急诊经皮冠状动脉(冠脉)介入治疗，都是挽救心肌最广泛采用的方法[1]。然而，人们发现在心肌组织血流恢复后反而出现了组织细胞损伤加重的状态，即缺血再灌注损伤，引起心肌功能障碍及心律失常的发生，严重影响患者预后[2]。如何减轻再灌注损伤已经成为目前的研究热点。冠心舒通胶囊以广枣、丹参、丁香、冰片、天竺黄等中药药材以一定的比例所组成，是在现代中医药理论与蒙医蒙药理论相互贯通结合的基础上开发研制所成，冠心舒通胶囊有活血化瘀、通经活络、行气止痛的功效[3]。已有研究[3]451-453显示冠心舒通胶囊对心肌缺血再灌注损伤有保护作用。本研究欲通过建立大鼠心肌缺血再灌注模型，拟研究冠心舒通胶囊通过调节p53、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)蛋白的表达，保护大鼠心肌缺血再灌注损伤，并探讨其可能机制。

1 仪器和材料

1.1 仪器 DH-150型动物人工呼吸机(浙江医科大学仪器实验厂)；BIO-RAD电泳槽(美国伯乐公司)；DNM-9602G酶标分析仪(上海京工实业有限公司)。

1.2 药品与试剂冠心舒通胶囊由陕西步长制药有限公司提供，规格为0.3克/粒，生产批号为100519。凯基TUNEL(原位末端转移酶标记技术)细胞凋亡原位检测试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司)。兔抗大鼠p53多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)。兔抗大鼠Caspase-9多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.3 动物健康成年雄性SD大鼠30只，体重250～300 g，由锦州医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(辽)2003-0007。

2 方法

2.1 分组和给药健康成年雄性SD大鼠30只，分笼饲养，自由饮水，实验前适应性喂养1 w。随机分为3组，每组10只：对照组(0.9%氯化钠盐水2 mL，日2次，早晚各1次)、缺血再灌注组(0.9%氯化钠盐水2 mL，日2次，早晚各1次)、冠心舒通胶囊组(冠心舒通胶囊组每次按1.5 g /kg，溶于2 mL生理盐水中，每日2次灌胃，早晚各1次)，3组均连续灌服5 d。除对照组外，缺血再灌注组、冠心舒通胶囊组5 d后制作大鼠在体心肌缺血再灌注模型。

2.2 在体大鼠心肌缺血再灌注模型的建立[4]SD大鼠用10%乌拉坦(5 mg/kg)行腹腔麻醉后手术台固定，取颈正中切口，分离颈总动脉，准备实验结束时动脉插管取血。气管插管进行机械通气。于胸骨左旁第2～3 肋间行纵行切口，分离胸大肌及肋间肌，结扎肋间动静脉，剪断肋骨，破胸膜、心包膜。在左心耳下缘冠状动脉左前降支(LAD)起始部处用6.0 聚丙烯纺织纤维线穿线，留线暂不结扎，待血压、呼吸稳定10～15 min后再收紧结扎线。结扎之前在预结扎的LAD处放置一根长约0.5 cm、直径1.5 mm的乳胶管。LAD 缺血30 min 后再松开活结进行再灌注，再灌注120 min。冠脉LAD结扎成功标志：结扎线远端心肌颜色发绀，心电图表现为ST段进行性抬高和(或)T波高耸和(或)QRS高大增宽。再灌注成功标准：剪断结扎线后，心电图ST段回落50%以上或者缺血部位心肌颜色恢复[3，5]451-453。

2.3 生化指标测定

2.3.1 肌酸激酶同工酶(CK-MB) 再灌注结束后，颈动脉插管采血1.0 mL，离心(3 000 r·min-1，10 min)，取血清置于-80 ℃冰箱保存，应用全自动生化分析仪(日立7170A)测定CK-MB。

2.3.2 免疫印迹法(Westernblotting)测定p53、caspase-9的蛋白表达取各组大鼠的心肌进行蛋白制样。蛋白质样品得制备及定量:取-80 ℃深低温保存的心肌组织约100 mg，加入1 mL细胞裂解液，匀浆破碎，4 ℃离心15 000 r·min-1，30 min 取上清，BCA法测定蛋白质含量，制成含蛋白量相等的样品。行SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳。然后将蛋白电转到硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂奶粉的TBS中封闭，加入一抗，4 ℃封闭过夜；第2天，TBS洗膜3次，加入辣根过氧化物酶偶联的二抗室温下摇床上孵育1 h；按Western blot发光试剂盒说明书显影，用Image J测定各蛋白的相对光密度值，以β-actin为内参。

2.3.3 TUNEL细胞凋亡原位检测方法检测细胞凋亡率再灌注120 min麻醉经颈动脉取血后，取出心脏，将缺血区心肌组织(左心室前壁中间段)剪下，10%中性甲醛固定24 h，常规石蜡包埋，采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法，按照试剂盒说明进行心肌组织切片细胞凋亡的原位检测。光镜下正常心肌细胞核呈蓝绿色，凋亡细胞核呈深浅不一的棕褐色。每张切片于凋亡细胞分布区域各取5个高倍视野，计算出平均100个细胞中的凋亡细胞数，并以百分数(%)表示凋亡指数(apoptotic index，AI)

2.4 统计学处理用SPSS16.0统计软件进行数据分析，计量分析以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较比较应用SNK法，以P<0.05表示有统计学意义。

3 结果

3.1 血清CK-MB的测定与正常组相比，模型组的CK-MB水平明显上升(P<0.05)，与模型组相比，冠心舒通胶囊组CK-MB明显下降(P<0.05)，见表1。

3.2 冠心舒通胶囊对心肌组织p53、Caspase-9的蛋白表达的影响与对照组相比，其余各组的p53、Caspase-9蛋白表达明显上升(P<0.05)，与模型组相比，冠心舒通胶囊组的p53、Caspase-9蛋白表达明显降低(P<0.05)，见图1。

表1 冠心舒通胶囊对大鼠心肌CK-MB、凋亡指数的影响

注：与对照组相比★P<0.05；与模型组相比▲P<0.05

3.3 冠心舒通胶囊对心肌细胞凋亡的影响 TUNEL法检测结果显示：与对照组相比，其余各组的心肌细胞凋亡指数明显增加(P<0.05)，与模型组相比，冠心舒通胶囊组的心肌细胞凋亡指数明显减少(P<0.05)，见表1、图2。

4 讨论

冠心舒通胶囊系蒙古民间验方，临床用于治疗心血瘀阻型冠心病所引起的胸痛、胸闷心慌、气短等症，临床研究证实其具有较好的抗心绞痛作用。实验研究也证实其具有抗心肌缺血、抗缺氧、降脂等作用[3，6]451-453。心肌缺血再灌注损伤是指急性缺血的心肌再恢复血流后组织损伤反而加重，甚至发生不可逆性损伤的现象[7]。它是由多种炎症因子及多细胞信号通路参与的复杂的炎症损伤反应，其具体机制涉及氧化应激，线粒体损伤及钙超载等[8]。心肌缺血再灌注损伤发生过程中心肌细胞的过度凋亡是再一次导致心肌损伤的重要原因，心肌细胞发生凋亡作为缺血再灌注损伤的早期事件，贯穿于缺血再灌注损伤的病理生理过程[9]。

细胞凋亡是受基因调控的一种程序性的细胞死亡，参与心肌细胞凋亡的主要调控基因有Bc1-2、p21、Fas、p53、热休克蛋白及Caspase家族蛋白酶。p53是一种重要的抗癌基因，与细胞凋亡关系密切[10]。研究[10]6507-6521表明p53基因是心肌细胞凋亡的激活因子，应用抑制剂抑制p53基因的表达，可以减轻细胞的凋亡。p53可以从胞浆转移到线粒体表面，从而激活内源性线粒体损伤途径。Caspase蛋白酶家族是细胞凋亡的关键执行者，caspase-9作为该家族的重要一员，介导线粒体依赖途径的细胞凋亡过程，最终激活了Caspase-3这一细胞凋亡效应基因，进而引发Caspase级联反应，导致细胞凋亡[11]。

本实验结果显示，与模型组相比，冠心舒通胶囊组心肌细胞凋亡指数明显下降，CK-MB的水平也明显降低，提示冠心舒通胶囊可以抑制大鼠缺血再灌注损伤所致的细胞凋亡而发挥保护作用。本实验对p53、Caspase-9途径的蛋白表达进行了测定，发现与模型组相比，冠心舒通胶囊组心肌组织p53、Caspase-9的表达明显下降，提示冠心舒通胶囊可能通过抑制p53、Caspase-9的表达，从而抑制内源性线粒体损伤途径的激活，减少心肌再灌注时的细胞凋亡，减轻再灌注损伤。

综上所述，冠心舒通胶囊可以明显减少缺血再灌注后的心肌细胞凋亡，减轻再灌注损伤，可能与其抑制p53、Caspase-9表达有关。本研究为冠心舒通胶囊能够减轻再灌注损伤提供了一定的实验依据，但应用于临床，仍需大量临床实验。

(此文图1-2见附页4)

文见第12-14页