熊果苷透皮组合配方的优化

薛榆洁 胡歆滢 张 慧 何逸昉 童鹤艳 许 可

（1.温州医科大学药学院，浙江 温州 325000；2.温州大学生命科学研究院，浙江 温州 325000）

熊果苷又名熊果素，化学名是4-羟基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷，是一种源于杜鹃花科熊果属植物-熊果的叶子中分离的一种苷类化合物。随着国外越来越多的专利到期，过去只能在高档护肤品中才能用的熊果苷也越来越普及。熊果苷有2个化学结构式：α-熊果苷和β-熊果苷，葡糖残基和酚基是熊果苷的两个重要功能基团，其中酚基对酪氨酸酶（人体合成黑色素关键酶）具有很强的抑制作用，此外熊果苷属于氢醌葡萄糖苷类化合物，作为护肤品美白添加剂，其在一定条件下，分子中的葡萄糖分子与氢醌之间形成的类糖苷键具有断裂的可能性。然而国内对熊果苷性质的基础理论研究较少，导致护肤品行业中添加熊果苷缺少相关理论依据，并且近年来人们对护肤品中熊果苷的毒性以及副作用也提出了质疑，因此加强对熊果苷理化性质研究具有重要的意义。本课题通过研究不同产地及构型熊果苷美白及安全性，渗透剂组合对熊果苷经皮渗透的影响以及护肤品基础条件如pH值、氧气等对熊果苷稳定性的影响，筛选出熊果苷用于护肤品的最优组合或配方。

1 仪器与材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪（安捷伦，美国），多功能酶标仪（MD，美国），正置荧光显微镜（尼康，日本），YB-P6 智能透皮试验仪（天津药典标准仪器厂），电热恒温培养箱（上海森信实验仪器有限公司），细胞超净台（苏洁净化设备公司）。

1.2 试剂

α-熊果苷（荷兰皇家帝斯曼集团），α-熊果苷及β-熊果苷（西安奥赛生物），B16黑色素细胞（上海中乔新舟），酪氨酸及酪氨酸酶（上海阿拉丁生物有限公司），CCK-8（碧云天生物有限公司），PBS磷酸缓冲液（自配），甲醇（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司），水溶性氮酮（西安奥赛生物），甘油（上海麦克林生化科技有限公司）。

1.3 动物

小鼠，雄性，体重（20±2）g，购于南京大学模式动物研究所。

1.4 酶标仪检测酪氨酸酶活性

体外酪氨酸酶活性检测：按顺序依次加入磷酸盐缓冲液1mL、样品溶液（熊果苷或熊果苷+影响因素）0.5mL、酪氨酸溶液2.5mL，于37℃水浴10min。然后加入酪氨酸酶液1mL，混匀，再37℃孵育30min，迅速转移至比色皿中，在475nm处测定吸光度。

细胞酪氨酸酶活性检测：细胞培养48 h后弃上清液，每孔加入含1%TritonX-100的PBS缓冲液90μL，加入10μL 1mg/mL的左旋多巴（L-DOPA），37℃孵育60min后，用酶标仪检测475nm下各孔的OD值。计算细胞内酪氨酸酶的活性。酪氨酸酶活性=（试验孔OD475nm-空白孔OD475nm）/（对照孔OD475nm-空白孔OD475nm）。

1.5 熊果苷经皮渗透试验

将小鼠断颈处死后，用电动剃须刀剌干净腹部的毛，用手术剪小必剪取腹部的皮肤，剔除表皮下的脂肪和粘连物，用生理盐水反复清洗干净，置在生理盐水中，保存在冰箱里备用（在一周之内使用），实验前自然解冻小鼠皮，并用生理盐水反复清洗干净。采用改良的Franz扩散池法，利用智能透皮试验仪，将离体鼠皮平固定于扩散池和接收池么间，并使角质层面向供给扩散池。扩散池加入熊果苷或熊果苷+基础原料等，接收池中加入PBS缓冲液，加入过程中保证气泡排出，并加入磁力搅拌子，恒温水浴在37℃，实验开始于3h取样1mL，0.22μm微孔过滤后，HPLC检测。

1.6 熊果苷稳定性实验

将熊果苷组或熊果+不同基础环境组（不同pH值组，含氧及不含氧组）置于50℃恒温培养箱当中，放置1个月以上（高温加速试验）。然后取出样品，观察颜色变化。

1.7 统计学处理

数据采用Origin8.0软件进行统计学分析，两组间数据比较采用t检验，P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 体外水平研究不同来源及构型熊果苷对酪氨酸酶活性抑制情况

本研究分别选取荷兰帝斯曼的α-熊果苷（1kg/1万），国产α-熊果苷和β-熊果苷来研究不同原料产地以及构型对黑色素生成的关键酶-酪氨酸酶活性的影响。体外研究发现，熊果苷能有效抑制酪氨酸酶的活性，其中进口α-熊果苷对酪氨酸酶活性抑制率高于国产α-熊果苷和β-熊果苷。接下来，我们考察了部分护肤品基质原料对熊果苷酪氨酸酶抑制活性的影响，从图1（b）我们可以发现，甘油、聚乙烯醇及水溶性氮酮对α-熊果苷酪氨酸酶抑制活性影响不大，而烟酰胺和山梨酸钾促进了熊果苷酪氨酸酶抑制效率。这些研究表明，进口α-熊果苷具有更好的酪氨酸酶抑制活性，同时一般护肤品基质如渗透剂、防腐剂、保湿剂等对熊果苷酪氨酸抑制活性影响较小。

2.2 细胞水平研究不同产地、构型熊果苷对黑色素细胞B 1 6活性及酪氨酸酶活性抑制情况

从体外水平我们发现进口α-熊果苷酪氨酸酶抑制效果更好，为验证不同产地熊果苷的潜在毒性，本研究选择不同浓度α-熊果苷去处理B16细胞，CCK-8结果显示随着熊果苷浓度升高，熊果苷毒性逐渐增强，表明熊果苷在一定浓度范围毒性可控，此外相同浓度下进口α-熊果苷毒性明显低于国产α-熊果苷（如图2（a）所示）。光镜图也显示相同浓度下进口α-熊果苷比国产于α-熊果苷毒性更小，B16细胞数目更多，细胞饱满度更好（如图2（b）所示）。

接下来我们在细胞水平进一步验证国产α-熊果苷及β-熊果苷对细胞酪氨酸酶抑制活性。在考虑细胞毒性情况下，研究α/β-熊果苷对细胞酪氨酸酶活性抑制情况，同样发现熊果苷能抑制B16细胞酪氨酸酶活性，与体外结果不同的是，α-熊果苷抑制效率更优于β-熊果苷（如图3所示）。结合上述体内和细胞研究，我们可以得出，α-熊果苷具有更好的酪氨酸酶抑制活性，同时进口α-熊果苷安全性能更好。因此接下来我们选取进口α-熊果苷进行深入的研究。

2.3 熊果苷经皮渗透的研究

几乎所有分子透过表皮的量都是微量级的，所以护肤品中常常添加一些透皮促进剂如氮酮等，此外发现一些多元醇类也能促进药物吸收，本研究初步考察了水溶性氮酮和甘油单独或联合使用对熊果苷经皮渗透的影响。α-熊果苷高效液相条件摸索：色谱柱Syncronis™ C18柱，4.6mm×150mm，ID=5μm；流动相∶水∶甲醇 =80∶ 20（v/v）；流速：0.5mL•min-1；检测波长为280nm；进样量为10μL。熊果苷HPLC高效液相如图4所示。

我们接下来选取了护肤品常用化学促渗透剂-氮酮以及保湿剂-甘油，来研究二者对熊果苷经皮渗透的影响（如图5（a）所示）。研究发现，随着甘油添加量逐渐升高，熊果苷渗透率也逐渐增高，而氮酮+甘油则能显著促进熊果苷经皮渗透效果（如图5（b）所示），说明二元促渗剂具有协同促熊果苷的经皮渗透。此外，不少护肤品公司选取更加温和的试剂来替代氮酮，例如戊二醇和己二醇等，这值得我们继续深入地研究复合多元醇的渗透性能。

图1 不同产地、构型熊果苷及基础原料加熊果苷对酪氨酸酶活性的影响

图2 熊果苷对B16黑色素细胞生长的影响

2.4 护肤品基质环境对熊果苷稳定的影响

熊果苷由于分子间的葡萄糖分子与氢醌之间形成的类糖苷键容易受到氧气、光照、pH值等影响而发生断裂，而发生变色。笔者了解到不少护肤品公司相关熊果苷产品在保存半年左右就出现了变色问题，这极大地影响了产品的销售。因此本项目初步考察了不同pH值（5，6和7，pH4对皮肤伤害太大故舍弃）以及氧气对熊果苷稳定的影响，研究发现在高温加速条件下（相当于常温12个月），pH7熊果苷溶液（1%）变色颜色最深，而pH5颜色最浅（如图6（a）所示）；通过添加亚硫酸氢钠来去除氧气的影响，发现添加亚硫酸氢钠后，熊果苷溶液（1%，pH6）颜色透明澄清，而未添加亚硫酸氢钠熊果苷溶液（1%，pH6）组颜色变黄（如图6（b）所示）。这些实验证明熊果苷的类糖苷键在弱酸环境下比较稳定，同时在体系中添加亚硫酸氢钠去除氧气同样能有效保持熊果苷的澄清透明。接下来我们将继续研究护肤品添加剂对熊果苷稳定性的影响。

图3 熊果苷对B16黑色素细胞黑色素酶抑制的影响

图4 熊果苷高效液相色谱图

图5 熊果苷高效液相色谱图

图6 护肤品基础环境对熊果苷稳定性的影响

结论

熊果苷目前作为高端护肤品中美白添加剂，目前在面膜、精华液中应用越来越广，国外对熊果苷的相关研究较早，而我国对熊果苷用于护肤品的研究则相对有限，很多护肤品公司在添加熊果苷时候，对α和β-熊果苷基础环境未做深入研究。本研究初步比较了不同品牌和构型的熊果苷美白抑制效果和细胞毒性，同时研究了目前护肤品中常用促渗透剂对熊果苷经皮渗透的影响，最后研究了护肤品基础条件对熊果苷稳定的影响。然而本研究还有许多地方研究的不深入，例如目前多元促渗透剂能否进一步促进熊果苷经皮吸收，熊果苷在最优保存条件下是或还会产生微量的对苯二酚，这都需要我们进一步关注。