HOXB3在结直肠癌中的表达及其临床意义

林秀欣 刘森观 周颖 余更生 周伟

1江门市中心医院肿瘤科（广东江门 529030）；2遵义医学院附属第五医院急诊科（广东珠海 519170）

结肠癌是我国胃肠道系统中较常见肿瘤之一，位居我国肿瘤发病率第5位，但其病死率却仅次于肺癌位居第二位，且随着人们生活节奏的加快和饮食结构的变化，其发病率有逐年上升趋势，严重危害了我国居民身体健康［1-3］。早期结直肠癌患者的预后很好，晚期结直肠癌患者预后明显变差。多项研究显示，疾病的早期诊断及准确评估预后，对肿瘤患者的生存期延长具有重要意义［4-5］。近年来，随着基因检测技术的进步，结直肠癌的K⁃ras、BRAF、MSI、MMR等生物标记物的研究进展在肿瘤治疗取得很大的进展，但是这些标志物在临床实践中的指导意义仍十分有限。因此，寻找与结直肠癌的诊断和进展相关的新生物标志物，对鉴别高风险患者可能受益于更积极的临床干预具有重要价值。HOXB3是HOXB家族成员，该基因家族参与胚胎发生发育过程，调控细胞分化和增殖。最近文献报道，HOXB3在乳腺癌的内分泌治疗耐药、白血病细胞的分化及卵巢癌减瘤术后的复发有关［4-6］，表明HOXB3在多种肿瘤的发生发展中扮演重要角色。但是，HOXB3在结直肠癌中的表达及临床病理意义未见相关报道。本研究通过免疫组织化学的方法检测结直肠癌患者组织中的HOXB3的表达，发现HOXB3在结直肠癌中也高表达，进一步分析发现，HOXB3与结直肠患者的不良临床病理因素相关，高表达HOXB3的患者预后也更差。因此笔者推测HOXB3有可能作为结直肠癌的一个肿瘤标志物，有助于该病的早期发现和治疗。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料以2012年1月至2013年8月209例结直肠癌患者手术切除结直肠癌组织为研究对象，男113例，女96例；年龄28～64岁，平均（48.9±5.3）岁；患者术前没有进行任何方式治疗。同时，本实验用了分别来自4个结直肠癌患者的成对的正常肠黏膜组织、结直肠癌组织、肺转移组织及肝转移组织。

1.2 方法采集患者相应标本后部分置于液氮中保存，部分使用4%多聚甲醛固定，进行免疫组化和病理分析。采用免疫组织化学方法（IHC）对比患者正常结直肠黏膜组织、癌旁组织及肿瘤组织、转移灶组织中HOXB3表达水平及临床病理特征。具体步骤为：（1）组织固定后，制作石蜡切片；（2）将切片进行脱蜡水化；（3）微波炉内6 min×4次对切片进行抗原修复；（4）切片温度降至室温后，使用PBS冲洗5 min×3次；（5）使用二抗试剂盒封闭内源性过氧化氢酶；（5）孵育一抗4℃过夜；（6）使用PBS冲洗5 min×3次后，室温孵育二抗；（7）PBS清洗后，DAB显色，镜下观察，适度反应后终止；（8）苏木精复染后，脱水，封片。镜下观察，棕黄色部分为阳性，在胞质中表达；只有蓝色的核，无黄色胞质的为阴性。

1.3 观察指标免疫组化结果显示HOXB3蛋白表达主要位于细胞浆内，阳性信号表现为棕黄色或棕褐色颗粒。根据阳性染色强弱程度积分，胞浆呈现淡黄色为1级；胞浆呈现棕黄色为2级，胞浆呈现棕色为3级。根据显微镜低倍镜观察阳性细胞计数，包括4个等级，0～10%为1级；10%～25%为2级；25%～50%为3级；50%～100%为4级。同样细胞的阳性表达浓度也包括4个等级，阴性表达为0级。将二者相乘，得分为0～12分，根据所有患者评分的中位数为界，0～4分表示低表达，大于等于6分表示高表达。以上判读结果由两位经验丰富的副主任级别以上病理医生共同决定。

1.4 统计学方法应用统计学软件SPSS20.0对数据进行分析，计数资料以构成比表示，组间比较采用χ2检验和Fisher确切概率。生存分析采用Kaplan Meier方法。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HOXB3在不同结直肠癌患者正常肠黏膜组织、肿瘤组织、转移灶组织中免疫组化情况首先检测了4例患者正常黏膜、肿瘤组织、肝肺转移灶。如图1所示，免疫组化检测结果显示其中一例患者的正常黏膜组织中几乎检测不到HOXB3的表达，但是在相应的来自同一患者的肿瘤组织中HOXB3的表达明显升高，免疫组化结果见到肿瘤组织中染色呈棕色到棕褐色。同样地，在相应的肺组织，肝组织的转移灶中HOXB3的表达也是高表达。

图1 HOXB3在结直肠组织、转移组织中的免疫组化结果Fig.1 HOXB3 expression in paired normal colorectal mucus，cancerous tissues and metastasis sites from 4 colorectal cancer patients

2.2 HOXB3表达水平相关因素分析进一步，本研究扩大样本量，在209个结直肠癌患者的肿瘤组织样品中检测HOXB3蛋白的表达水平。分析结果显示有108例（51.7%）患者HOXB3蛋白低表达，101例（48.3%）检测到强阳性高表达HOXB3蛋白。进一步相关性分析表明，HOXB3表达水平与与结直肠癌患者的临床分期（P＜0.001）、T分期（P＜0.001）、N分期（P＜0.001）显著相关，与患者性别、年龄无明显相关性，见表1。表明HOXB3的表达随着临床分期增加而表达上调，HOXB3可能与结直肠癌的临床发展相关。

2.3 HOXB3表达水平与结直肠组织病理特征关系如图2所示，不同临床分期的结直肠患者的HOXB3蛋白表达的免疫组化评分（材料方法中已详细说明）均值，如图所示，随着临床分期增加，HOXB3的表达评分升高。

2.4 HOXB3表达水平与患者生存关系Kaplan⁃Meier生存分析显示HOXB3高表达的结直肠癌患者的预后较HOXB3低表达的患者差（P＜0.05）。见图3。

表1 HOXB3表达水平相关因素分析Tab.1 Analysis of factors related to HOXB3 expression例（%）

图2 结直肠黏膜及不同临床分期结直肠癌患者组织中HOXB3蛋白表达的评分Fig.2 IHCscores of HOXB3 protein expression in normal colorectal mucus and different clinical stages

图3 HOXB3表达水平与患者生存关系Fig.3 HOXB3 expression and survival of colorectal cancer patients

3 讨论

结直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，也是严重危害人民健康的恶性肿瘤。关于其发病机制目前尚未完全阐明。结直肠癌的预后不佳与疾病发现的时间密切相关，早期发现疾病，早期治疗对患者的恢复十分重要［1-2］。

HOX基因家族在果蝇发育调控的相关研究中被发现并报道，后续的研究报道其在生物进化过程中具有保守型，HOXB3是HOX家族成员之一，它含有一段180个左右核苷酸的同源异形盒DNA结构，该段基因能够编码60个氨基酸残基［8］。同源盒基因编码的蛋白质是转录因子，对胚胎发育具有重要作用。对生物个体发育、形态发生、器官塑形等起到调控作用［9］。有报道显示，在正常早期造血干细胞有HOX基因表达，而发育成熟造血细胞HOX基因表达下调，其表达异常可导致白血病的发生。HOXB3对细胞的增殖与分化级迁移等具有促进作用，同时它也参与了生理与病理状态下血管的生成过程，比如，肿瘤的血管生成，淋巴管生成，内皮增生等［3-4］。文献报道，HOXB3对前列腺癌、胰腺癌及乳腺癌中表达增高，对肿瘤的发生及进展具有重要作用［11-15］。

本研究首次通过免疫组化的方法发现结直肠癌组织中HOXB3的蛋白表达水平明显高于来自同一患者的正常组织。进一步分析发现HOXB3高表达与结直肠癌患者的临床病理特征显著相关，这对临床结直肠癌患者的治疗具有重要作用，给临床提供了一定的理论依据。HOXB3表达较高者生存时间更短，这说明HOXB3表达较高患者预后较差，可以作为患者预后的一个评价指标。但是，本研究中由于病例数限制及技术有限，本研究结果可能存在一定偏差，需要进一步在更大样本量的研究中进一步验证。

综上所述，HOXB3的高表达与结直肠癌的发生、发展、转移及预后密切相关，可能是一个潜在的新的直肠癌的预后指标，HOXB3在结直肠癌的发生发展中的重要生物学功能和可能的分子机制功能需要进一步研究。