伊犁马COMT基因第1外显子多态性及其与心率的关联性

辛雅莉，王建文,2，曾亚琦,2，姚新奎,2，孟 军,2，王菊花

(1.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆农业大学马产业研究院，乌鲁木齐 830052)

0 引 言

【研究意义】儿茶酚胺氧位甲基转移酶(catechol-O-methyltransferase，COMT)是目前研究得最为广泛的神经递质相关基因，其产物为 COMT酶，可催化多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素及雌激素的降解[1]。COMT 在 Mg2+作用下催化由S-腺苷蛋氨酸提供的甲基转移到儿茶酚胺类物质的苯环3位羟基上，形成 3-甲氧基-4-羟基衍生物，从而使上述各物质降解[2]，从而进一步影响人或动物机体产生某些特殊行为(攻击、竞争等)，在受到某些特殊刺激的情况下，相关行为表现更为明显。通过特有行为的产生，会导致机体的生理生化指标发生变化甚至形成某些病症。在人类的COMT基因中，发现其由6个外显子组成，还有两个非编码的可选的启动子[3]。由于该基因在5'端的不同，表达合成两种酶：一种是膜结合蛋白(MB-COMT)，主要表现在大脑中，主要由前额叶皮质的多巴胺能神经元支配[4]，涉及到胆碱、多巴胺、去甲肾上腺素等多种递质的合成、转运、降解等代谢环节，认知的很多过程，特别是执行能力与这种膜结合蛋白关系密切；另一种是可溶性形式蛋白(S-COMT)在不同组织中均有表达。这两种形式的蛋白均参与了儿茶酚胺的分解代谢[5]。伊犁马性能与马匹的气质、行为有着密切的关系。通过研究伊犁马COMT基因的多态性及其与心率的关联关系，为该基因功能性研究提供系统的基础数据和资料，对马匹的选择及早期选育具有重大意义。【前人研究进展】目前对COMT基因研究较为广泛，在人类疾病相关的研究中，COMT 基因的多态性会影响与儿茶酚胺、肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺代谢相关疾病[6]。同时发现多态性对认知、性格等有一定影响，这种影响与工作记忆密切相关，在不同基因型个体中工作记忆能力存在差异[7]。具体原因是由于多巴胺等神经递质的失衡，根据病因或大脑损害部位的不同，从而影响前额叶皮质功能，进一步导致记忆、执行功能、语言、运用、视空间结构技能等一项或多项功能缺陷[8]，比如男性精神分裂症的暴力行为[9]及重度抑郁症[10]等。此外，有研究发现广西红水河流域长寿家系COMT基因多态性与血压、血脂水平等相关[11]。在几乎所有的哺乳动物组织中都发现有 COMT 的分布。人和大鼠的肺 COMT 酶活性较高[12]。人、鼠、兔、猴、猪、鸡和狗的红细胞都发现了COMT，而且COMT酶活性存在差异，大鼠的偏高，人的偏低[13]。有研究显示，不同基因型COMT酶活性也存在差异[14]。目前已筛选出了众多与狗、马、鼠等动物行为、性格有关的候选基因，其中就有COMT基因。动物存在分离焦虑症，小鼠、犬、猴子和猪等具有分离焦虑行为与COMT基因多态性有关[15]。敲除COMT基因可导致雄性小鼠产生攻击性行为，可导致雌性小鼠情绪低落[16]。杨虹等[17]研究发现COMT基因对马的竞争性行为也有较大影响。【本研究切入点】马匹的工作性能与其气质和行为有着密切的联系，特别在运动性能方面尤为明显。心率作为一个重要的生理指标，能够客观评价出动物在应对外界不同程度压力与刺激下的反应[18]，一定程度上反应了马匹的气质和行为。气质、行为等性状是神经元及由神经元所构成的神经元回路对外界刺激的综合性反应，COMT酶对其有重要的调节作用[19]。针对目前相关研究有限，开展伊犁马COMT基因的多态性及其与心率的关联研究。【拟解决的关键问题】从分子生物学角度，对伊犁马COMT基因的多态性及其与心率的关联进行研究，为马匹的选择鉴定、合理利用与品种培育提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试验动物

选取新疆伊犁昭苏马场35匹伊犁马，其中公马3匹，母马32匹，使用枸橼酸钠抗凝真空采血管，颈静脉采血3 mL，-20℃保存，用于提取马匹基因组DNA，同时采集伊犁马静息心率、温和刺激心率及剧烈刺激心率。

1.1.2 主要试剂及仪器

Tris碱、Tris饱和酚、DL2000 DNA Marker、6×Loading Buffer、EDTA、NaOH、NaCl、氯仿：异戊醇(24∶1)、无水乙醇、SDS、硼酸、琼脂糖、超纯水、2×TaqPCR Mix。

水平电泳槽、电泳仪、电子分析天平、高速离心机、凝胶成像系统、PCR仪、酶标仪等。

1.2 方 法

1.2.1 心率数据信息

使用polar v800心率表对马匹静息心率、温和刺激心率及剧烈刺激心率进行采集。

1.2.2 引物设计及PCR扩增

采用酚—氯仿法对伊犁马血液样品基因组DNA进行抽提。用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，使用酶标仪对DNA浓度进行测定，-20℃保存。

参照GenBank中公布的位于马8号染色体上的COMT基因序列(登录号NC_009151)，以COMT基因第1外显子为目标片段，采用Primer5.0软件设计引物，引物序列为：F：5'-CACAAAGCACTGAAGCCTGG-3'；R：5'-GTGTCAGGGTCTCAGCAAGG-3'，预计片段长度为538 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

PCR反应体系20 μL：ddH2O 8.0 μL、2×TaqPCR Mix 10 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA模板1.0 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸35 s，33个循环，72℃延伸10 min；4℃保存。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。目的片段送由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.3 数据处理

将测序得到的DNA序列用 DNAStart软件进行序列拼接、比对，筛选SNPs位点。应用Excel软件分别计算不同位点在受试群体中的基因型频率、等位基因频率、有效等位基因数(Ne)、群体遗传纯合度(Ho)、多态信息含量(PIC)并检验是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。采用Haploview 4.2软件计算SNPs的连锁不平衡参数，并构建单倍型。采用SPSS 20.0软件对基因多态性与心率进行关联分析。

2 结果与分析

2.1 基因测序

研究表明，在试验选取马匹COMT基因第1外显子上发现8个突变位点，各突变位点的具体信息如表1所示。其中SNP1突变为错义突变，突变使得COMT的第36个氨基酸由天冬酰胺变为谷氨酸； SNP2突变为错义突变，突变使得COMT的第37个氨基酸由谷氨酸变为赖氨酸； SNP3突变为无义突变，突变使得COMT至第38个氨基酸转变为终止子； SNP4突变为错义突变，突变使得COMT第39个氨基酸由异亮氨酸变为缬氨酸； SNP5突变为错义突变，突变使得COMT第59个氨基酸由组氨酸变为谷氨酰胺； SNP6突变为同义突变； SNP7突变为错义突变，突变使得COMT第88个氨基酸由天冬酰胺变为异亮氨酸；SNP8突变为错义突变，突变使得COMT第91个氨基酸由天冬氨酸变为天冬酰胺。表1

表1 COMT基因第1外显子SNPs信息

Table 1 The information of SNPs of COMT gene exon1

位点SiteEquCab 3.0位置EquCab3.0 Position突变类型Substitution type氨基酸位置Amino acid position氨基酸Amino acidSNP1g.429149 A>C错义突变36Asn-GluSNP2g.429152 G>A错义突变37Glu-LysSNP3g.429157 C>A无义突变38终止SNP4g.429158 A>G错义突变39Ile-ValSNP5g.429220 T>A错义突变59His-GlnSNP6g.429286 G>A同义突变81SerSNP7g.429306 A>T错义突变88Asn-IleSNP8g.429314 G>A错义突变91Asp-Asn

2.2 遗传学

对检测出的突变位点进行基因(型)频率及多态信息含量等参数进行计算。研究表明，SNP2和SNP6只检测到两种基因型，其余6个突变位点均检测到三种基因型。SNP1优势等位基因为A，优势基因型为AA；SNP2优势等位基因为G，优势基因型为GG；SNP3优势等位基因为C，优势基因型为CC；SNP4优势等位基因为A，优势基因型为AA；SNP5优势等位基因为T，优势基因型为TT； SNP6优势等位基因为G，优势基因型为GG； SNP7优势等位基因为A，优势基因型为AT；SNP8优势等位基因为G，优势基因型为GG。根据多态信息含量PIC的分类，SNP5和SNP7属于中度多态(0.250.05)，其余各突变位点均呈现Hardy-Weinberg不平衡状态(P<0.05)。表2

表2 COMT 基因第1外显子SNPs分析

Table 2 The genotype frequency, allele frequency and genetic diversity of SNP sites of COMT gene exon1

基因型频率(%)Genotypic frequency等位基因频率/%Allelic frequencyPICHeNeH-W P值H-W P valueSNP1AAACCCAC85.712.8611.4387.1412.860.200 00.224 11.288 83.99E-07SNP2GGGAAAGA88.57011.4388.5711.430.182 00.202 41.253 86.05E-09SNP3CCCAAACA88.572.868.570.90.10.16380.180 01.219 51.43E-06SNP4AAAGGGAG85.712.8611.4387.1412.860.199 00.224 11.288 83.99E-07SNP5TTTAAATA62.8614.2822.8670300.331 80.420 01.724 10.000 1SNP6GGGAAAGA88.5711.43094.295.710.102 00.107 81.120 81.000 0SNP7AAATTTAT28.5757.1414.2957.1442.860.369 80.489 81.960 00.364 7SNP8GGGAAAGA80.0014.295.7187.1412.860.199 00.224 11.288 80.056 0

2.3 连锁不平衡

通过Haploview 4.2软件构建伊犁马COMT第1外显子的连锁不平衡图谱，并进行连锁不平衡分析，研究表明，在试验样本中，各突变位点中存在较多的连锁，其中SNP1和SNP4完全连锁，SNP1和SNP2、SNP3、SNP5、SNP6，SNP2和SNP3、SNP4、SNP6，SNP3和SNP4、SNP8，SNP4和SNP5、SNP6，SNP6和SNP8间存在强的连锁不平衡(D’>0.75， r2>0.33)，其余各突变位点间连锁关系相对较弱。图1，表3

图1 连锁不平衡

Fig.1Linkagedisequilibriumanalysis

表3 COMT基因第1外显子基因多态位点配对连锁不平衡

Table 3 Analysis of pairwise linkage disequilibrium in COMT gene exon1

位点SiteSNP1SNP2SNP3SNP4SNP5SNP6SNP7SNP8SNP11.0001.0001.0001.0001.0001.0000.744SNP20.8750.8391.0001.0001.0001.0000.713SNP30.7530.6061.0001.0000.7221.0000.835SNP41.0000.8750.7531.0001.0001.0000.744SNP50.3440.3010.2590.3441.0000.7260.841SNP60.4110.470.2850.4110.1411.0001.000SNP70.1970.1720.1480.1970.3010.0811.000SNP80.5530.4450.5250.5530.2440.4110.197

注：对角线右上方为D’，左下方为r2

Note： D’ are above the diagonal for SNPs. r2are below the diagonal for SNPs

2.4 单倍型构建

通过Haploview 4.2软件对各突变位点进行单倍型构建，在试验样本中，COMT基因第1外显子共构建9种单倍型，各单倍型频率位于1.40%～52.30%，其中优势单倍型为H1(AGCATGAG)。通过对突变位点进行比对，在试验样本中，共发现8种单倍型组合，各单倍型组合频率位于2.86%～31.43%，其中优势单倍型组合为H1H2。表4，表5

表4 COMT基因第1外显子单倍型频率

Table 4 Haplotype frequencies within the COMT gene exon1

单倍型HaplotypeH1H2H3H4H5H6H7H8H9序列 SequenceAGCATGAGAGCATGTGAGCAAGTGCAAGAGTACAAGAATAAGCAAGAGAGCAAGAAAGCATGTACGAGAGTA频率 Frequency52.30%16.30%12.30%3.60%3.60%3.40%1.40%1.40%1.40%

表5 COMT基因第1外显子单倍型组合频率

Table 5 Diplotype frequencies within the COMT gene exon1

单倍型组合DiplotypeH1H1H1H2H1H3H1H8H3H6H3H7H3H9H4H5频数 Absolute frequency1011512112频率 Frequency28.57%31.43%14.29%2.86%5.71%2.86%2.86%5.71%

2.5 SNPs位点及单倍型组合与心率的关联

COMT基因第1外显子SNPs位点与马匹静息心率、温和刺激心率及剧烈刺激心率的关联分析为，在SNP1和SNP4中，AA型、AC(AG)型和CC(GG)型的三种心率差异均不显著(P>0.05)；在SNP2中，AA型的剧烈刺激心率显著性大于GG型(P<0.05)，其余两种心率差异不显著(P>0.05)；在SNP3中，AA型的温和刺激心率极显著性大于CC型(P<0.01)，其余两种心率差异不显著(P>0.05)；在SNP5中，AA型的温和刺激心率和剧烈刺激心率均显著性大于TA型(P<0.05)，TT与AA、TA之间差异性不显著(P>0.05)；在SNP6中，GA型的剧烈刺激心率显著性大于GG型(P<0.05)，其余两种心率差异不显著(P>0.05)；在SNP7中，TT型的剧烈刺激心率极显著性大于AA型及AT型(P<0.01)，其余两种心率差异不显著(P>0.05)；在SNP8中，GA型的剧烈刺激心率极显著性大于GG型(P<0.01)，其余两种心率差异不显著(P>0.05)。挑选样本量相对较多(大于3个样本)的COMT基因第1外显子单倍型组合与马匹静息心率、温和刺激心率及剧烈刺激心率进行关联分析，结果显示H1H2单倍型组合剧烈刺激心率显著性大于H1H3单倍型组合(P<0.05)，H1H1单倍型组合与H1H2、H1H3单倍型组合剧烈刺激心率差异不显著(P>0.05)，三种单倍型组合其余两组心率间差异不显著(P>0.05)。表6

表6 COMT基因第1外显子SNPs位点及单倍型组合与心率的关联

Table 6 Association between SNPs of COMT gene exon1and heart rate

静息心率温和刺激心率剧烈刺激心率SNP1AA(30)45.90±10.3459.10±14.5785.87±20.14AC(1)53.0057.00171.00CC(4)47.50±7.1468.00±11.63118.50±44.16SNP2AA(4)47.50±7.1468.00±11.63118.50±44.16aGG(31)46.13±10.2459.03±14.3388.61±25.01bSNP3AA(3)48.33±8.5073.67±3.21A102.33±36.83CA(1)53.0057.00171.00CC(31)45.87±10.1658.00±14.40B88.48±24.58SNP4AA(30)45.90±10.3459.10±14.5785.87±20.14AG(1)53.0057.00171.00GG(4)47.50±7.1468.00±11.63118.50±44.16SNP5AA(8)47.25±10.1469.13±19.55a107.63±45.13aTA(5)42.40±12.5656.60±11.33b71.40±12.95bTT(22)46.82±9.4357.55±11.56ab91.05±20.42abSNP6GA(4)47.50±7.1468.00±11.63118.50±44.16aGG(31)46.13±10.2459.03±14.3388.61±25.01bSNP7AA(10)48.20±8.9954.90±12.4888.90±14.11BAT(20)44.75±10.9861.20±15.3785.85±22.90BTT(5)48.60±6.6665.80±11.21129.00±44.87ASNP8AA(2)52.50±6.3672.50±3.5499.50±51.62ABGA(5)53.00±10.6568.40±15.84126.00±40.71AGG(28)44.64±9.5057.68±13.6385.43±20.54BH1H1(10)48.20±8.9954.90±12.4785.90±14.11abH1H2(11)44.00±8.5959.09±11.0494.55±25.30aH1H3(5)42.40±12.5656.60±11.3371.40±12.95b

注：同一基因型同列肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异性显著(P<0.05)

Note： Different capital and lowercase letters indicate significant difference of different genotypes of one same SNP site atP<0.01 andP<0.05 level, respectively

3 讨 论

3.1 COMT基因第1外显子多态性

COMT基因位于人类第22号染色体，家鼠第16号染色体，狗第26号染色体，马第8号染色体。在基因编码区导致多态性的众多位点中，最受关注、研究最热的位点是第158位氨基酸(VAL→Met)位点，该位点可导致COMT酶活性降低3～4倍[20]。在人和动物的研究上，还发现了一些其他位点的突变，并对相关性状产生了一定的影响。在马的研究上，Y. Momozawa等[21]对纯血马COMT基因多态性研究发现G217A、C219T、A780G、C823A四个多态性位点，其中(g.429258)G217A导致氨基酸从丙氨酸到苏氨酸的改变，C219T同义突变，A780G、C823A为非编码区突变。查干其其格等[22,23]对内蒙古五个品种的马和纯血马 COMT 基因第二、四外显子多态性进行检测，发现存在突变位点。研究在COMT基因第1外显子上共发现了8个SNPs，相关突变以前并未报道，同时在此次实验样本中没有发现Y. Momozawa等[21]发现G217A、C219T两个突变。形成这一现象可能是由于品种间差异所导致。

3.2 COMT基因第1外显子多态性的遗传变异

He、Ne和PIC等遗传参数常用来评估群体的遗传多样性。此次试验选取的样本所检测出突变位点中，SNP5和SNP7属于中度多态，其余各SNP位点均属于低度多态。同时，对各SNP位点的Hardy-Weinberg平衡状态进行分析，SNP6、SNP7、SNP8处于平衡状态，其余各突变位点均呈现不平衡状态，说明试验所选取的样本并不是一个理想型的群体。导致形成这一现象的原因可以解释为：一、所选取样本量相对偏少；二、伊犁马属于培育品种，其形成年限较短，仅几十年，同时由于近年来伊犁马改良过程中又引入外血马的血液。对伊犁马COMT第1外显子突变进行连锁不平衡分析发现，在8个突变位点发现较多的强连锁现象，其中SNP1和SNP4完全连锁，这可能主要由此次试验所发现的突变的位置离的较近所导致，尤其是SNP1～4表现尤为明显。出现上述现象也说明伊犁马性能仍然处于优化过程中，其遗传仍不稳定，也就为伊犁马分化为新的类型或品系提供了新的可能。

3.3 COMT基因第1外显子对心率的影响

前人研究发现，将雄性鼠的纯合COMT基因敲除，结果表现出进攻性行为加强，而对雌性鼠进行敲除，结果表现出情绪低落[24]；犬第四外显子COMT不同基因型与分离焦虑的易感性有关[25]；蒙古马COMT基因第二外显子G217A突变显著影响其竞争性行为[22]；综上说明COMT基因对动物行为、气质、性格等质量性状存在较大的影响，但这些性状往往不好量化，前人相关研究集中采用调查问卷等主观形式。心率作为一个重要的生理指标，一定程度上反应了马匹的气质和行为，故试验创新引入心率这个数量性状进行分析，从数值上更能客观的反应COMT的影响机制[26]。当条件性刺激后，COMT的Val载体能更快适应环境突发事件的变化，促进对突变环境认知的稳定性[27]。此次的试验中心率方面收集了静息心率、温和刺激心率和剧烈刺激心率3组数据，也充分考虑了外界刺激这一因素。试验结果显示不同基因型、不同单倍型组合的3组心率在剧烈刺激心率差异最为明显，在温和刺激心率中也存在一定的差异，而静息心率中则没有发现差异。就COMT第1外显子不同基因型、不同单倍型组合在伊犁马上如何调节儿茶酚胺、多巴胺等物质代谢，如何影响马匹气质、行为和性格，气质、行为和性格等性状如何影响心率等生理数据变化的机制仍需进一步研究。

4 结 论

伊犁马COMT第1外显子上存在多态性，共发现8个突变位点，其中SNP1、SNP2、SNP4、SNP5、SNP7和SNP8为错意突变，SNP3为无义突变，SNP6为同义突变。不同突变间存在一定程度的强连锁，除SNP7与其余各突变间均无较强连锁外，SNP1-6、SNP8均存在一定的强连锁关系，SNP1和SNP4完全连锁。构建出9种单倍型，其中H1位优势单倍型，此次采集样本共形成8种单倍型组合，其中H1H2为优势单倍型组合。不同基因型、单倍型组合个体在心率上存在一定程度的差异，COMT基因可能是对伊犁马气质和生产性能影响的重要功能基因。