响应面法优化微波预处理浮萍还原糖研究

(徐州生物工程职业技术学院,江苏徐州,221006)

随着世界经济的不断发展，人们日益增长的物质需求和逐渐枯竭的能源以及环境的恶化形成尖锐矛盾。十九大之后，习总书记提出，“绿水青山就是金山银山”。洁净能源的开发与利用不仅可以缓解能源危机，也是实现环境优化的必经之路[3]。目前，在洁净能源的研究中，生物质能源作为可再生能源深受青睐。而在生物质能源的研究中，农作物秸秆是热点。然而农作物秸秆人们可利用的物质主要为纤维素。而纤维素与木质素等紧密相连，其结构难以破坏，因此不易被酶解，且酶解还原糖产量较少生产成本高，所以目前的秸秆综合利用率不高[2]。浮萍是一种水面浮生植物。当气候炎热潮湿，其生长迅速，多见于水田、池塘等静水水域。浮萍中淀粉含量丰富，但由于其极易吸收重金属、有机物等组分，因此不宜食用，也不宜作饲料使用。因此，浮萍是制备燃料酒精的最佳选择[4]。而欲制备燃料酒精，必先水解其淀粉使其成为还原糖。本文采用微波预处理，主要考察微波预处理时间、微波功率、固液比对酶解产生还原糖浓度的影响，并利用响应面法进行了工艺优化。

1 材料与方法

1.1 实验材料与器材

1.1.1 实验原料与器材

浮萍(徐州三环西路高架桥附近，打捞后进行烘干处理)；淀粉酶；Sartorius电子天平；水浴锅(星罗棋布公司)；微波炉(格力公司)；吸光光度计。

1.1.2 实验试剂

1.1.2.1 DNS溶液的制备

称取6.3g DNS和63mL的2mol/L的NaOH溶液，加入500mL去离子水(含有182g酒石酸钾钠)的溶液中，搅拌均匀，之后加入5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌使其溶解，冷却后加水定容至1000mL，低温保存于棕色瓶中[1]。

1.1.2.2 葡萄糖标准溶液的制备

精密称取干燥恒重的葡萄糖0.5g，经少量水溶解后加3mL 12mol/L的浓硫酸，以去离子水定容至1000mL，即为500mg/mL葡萄糖标准溶液。

1.2 实验方法

1.2.1 还原糖浓度的测定

1.2.1.1 葡萄糖标准曲线的绘制

取6支试管，按表1的顺序加入各种试剂。加入纯净水振荡后，在540nm下检测，以1号管为空白管，记录吸光度A为540nm，横坐标为吸光度，纵坐标为葡萄糖浓度，所拟合的曲线R值为0.9995，拟合度良好[1]。

1.2.1.2 还原糖浓度的测定步骤

从经过处理的浮萍中分别精密称取(0.5±0.01)g加入对应编号试管中，用移液管移取配制好的纤维素酶溶液2.5 mL，再加入pH值4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液25mL，混合均匀。50℃下，将上述混合溶液150 r/min振荡进行催化反应1 h后，置于沸水浴2min终止酶解反应，并滤纸过滤，之后迅速进行还原糖浓度的测定。用DNS法测定还原糖浓度(CRed)，并以此代表酶解效果[1]。

表1 葡萄糖标准曲线的测定方法

1.2.1.3 还原糖浓度的测定方法

先将试管放入沸水浴中 2 min，目的是使酶失活，接着吸取0.5 mL待测液加入试管中，加入DNS溶液1mL于沸水中水浴5 min后冷却，再加入8 mL蒸馏水，测定其吸光度，通过对照葡萄糖标准曲线，查出还原糖含量(mg)。如果待测液浓度超过标准曲线最大吸光度，则稀释一定倍数后再测[1]。

1.2.2 微波处理浮萍的响应面分析实验考察

表2 响应面实验设计中变量与编码

1.2.2.1 微波加热时间对微波处理的影响

在固液比1∶30，微波功率380 W时，将微波时间分别设置为2 min，4 min，6 min，8 min，10 min进行加热，结果见图1。

图1 微波加热时间对微波处理的影响

由图1可以看出当微波功率固定为380 W时，酶解还原糖浓度最高是在6 min。微波加热时间长短对酶解还原糖浓度都有影响。

1.2.2.2 微波功率对微波处理的影响

在固液比1∶30，微波加热时间6 min时，将微波功率分别设置为190 W，380 W，570 W，760 W，950 W进行加热，结果见图2。

图2 微波功率对微波处理的影响

由图2可以看出，当微波加热时间固定在6 min时，酶解还原糖浓度最高是在380 W。微波功率对酶解还原糖浓度影响较大，过高的功率会使酶解效率大大降低。

1.2.2.3 固液比对微波处理的影响

把不同固液比的浮萍固定其微波功率380 W，微波加热时间6 min做处理，结果见图3。

图3 固液比对微波处理的影响

由图3可以看出，当固定微波功率380 W，加热时间6 min时，酶解还原糖浓度最高是在1∶30。且由图表的变化趋势可以得出以下结论：固液比对酶解还原糖的影响比微波加热时间和微波加热功率小得多。

2 微波处理浮萍的响应面分析实验

2.1 响应面试验设计和实验结果

根据Box-Behnken Design(BBD)设计原则，选取微波加热时间、固液比、微波功率3个对微波处理影响较显著的因素,以还原糖浓度(g/mL)为响应值，得到的试验数据详见表3。

表3 浮萍微波处理响应面分析结果

2.2 二元多次回归模型分析

运用Design-Expert软件对表三的数据进行二次多元回归拟合，最终得到二次多元回归方程(Y为还原糖浓度)：

Y=24.41+1.15*A+0.44*B-0.37*C-3.75*AB-0.20*AC+2.500E-003*BC-2.36*A2-2.83*B2-1.09*C2。

表4 浮萍响应面分析实验中微波处理的分析结果

图4 微波加热时间和微波功率对还原糖浓度的影响

图5 微波加热时间和固液比对还原糖浓度的影响

图6 固液比和微波功率对还原糖浓度的影响

运用Design-Expert软件，进行二元多次模拟，得到二元回归方程的等高线和响应面(图4-6).从图4-6中可以看出，3个因素的交互作用对还原糖浓度影响显著，F值可以判断各个因素对还原糖浓度的影响程度，F值越大影响程度越显著。根据表3和图4-6可以判断微波加热时间与微波功率对实验影响最大。不同的微波加热时间得到的最高还原糖浓度所对应的微波功率也不一样。根据本文三个因素对实验的影响可以判断和确定最佳实验数据：微波加热时间5.64 min，微波功率350W，固液比1∶30，还原糖浓度在24.76 mg/mL。比普通实验提取还原糖的效率高了9.83%。

3 结论

本文研究了浮萍的预处理，利用响应面法对微波处理浮萍进行了工艺优化，并找出了显著性因素[2]。研究发现微波功率和微波加热时间协同作用下，微波功率过高会破坏浮萍的内部结构，微波温度过高或过低都会使酶解反应速率变慢，本实验中微波加热6 min，微波功率380 W时是实验的最佳处理数据，微波处理的功率既不会破坏浮萍的结构又能极快处理干燥浮萍。适宜的温度也能使酶解效果达到最佳。此时，还原糖浓度在24-30mg/mL之间，相比较微波处理纤维素的还原糖浓度高得多。为下一步制备燃料酒精提供基础。