左归饮水提物对大鼠Cyp2b1、Cyp2c11、Cyp2c7亚酶活性的影响

洪世忠，施哲媛，何 帆，张 盛，陈卫东

(安徽中医药大学，安徽 合肥 230012)

左归饮是滋阴补肾的常用方剂，出自《景岳全书》，由熟地黄、山药、枸杞子、山茱萸、茯苓和炙甘草组成。方中熟地黄是君药，味甘，性微温，归肝肾经，具有补血滋阴、填精益髓的功效；山茱萸是臣药，其味酸、涩，性微温，归肝、肾经。左归饮在临床上应用广泛，对围绝经期综合征、足跟痛、干燥综合征、眩晕证等疾病均有良好疗效[1-8]，尤其能改善围绝经期综合征的临床症状，具有延缓衰老的作用[9]。目前，鲜有左归饮对细胞色素氧化酶P450在体内代谢活性影响的文献报道[10]。CYP2是细胞色素氧化酶P450的主要组成之一，参与43%的药物代谢[11]，且有报道表明左归饮或其组分与Cyp2b6、Cyp2c8、Cyp2c9活性密切相关[12-14]。大鼠体内与之对应的酶是Cyp2b1、Cyp2c7和Cyp2c11[15]。基于此，本实验采用Cocktail探针药物法[16]，分别选用安非他酮、奥美拉唑[17]、阿莫地喹3种探针药物，研究左归饮对大鼠肝脏中主要代谢酶活性的影响，为临床合理用药提供参考。

1 材料

1.1 药材与试剂 熟地黄(河南，批号 161216)、山茱萸(浙江，批号 1701161)，炙甘草(甘肃，批号 160228)、山药(河南，批号 161223)、茯苓(安徽，批号 160506)、枸杞子(宁夏，批号 161017)。以上药材饮片均由安徽普仁中药饮片有限公司提供，所有药材经安徽中医药大学俞年军教授鉴定。超纯水：安徽中医药大学自制；甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)：上海星可高纯溶剂有限公司。

1.2 仪器 Agilent 1290 Infinity超高效液相色谱仪：美国Agilent公司；AB SCIEX4500三重四极杆串联质谱仪：美国AB SCIEX公司；AB135-S电子分析天平：德国METTLER TOLEDO公司。

1.3 动物 32只SD雄性大鼠，体质量180～220 g，由安徽医科大学实验动物中心[生产许可证号为SCXK(皖)2011-002]提供。饲养环境温度(25±2)℃，湿度为50%±10%。

2 方法

2.1 左归饮供试品的制备 根据《景岳全书》记载，称取熟地黄(9 g)、山药(6 g)、枸杞子(6 g)、炙甘草(3 g)、茯苓(4 g)、山茱萸(3 g)。按传统汤剂煎煮工艺，药材煎煮前用10倍水浸泡30 min，待煮沸后开始计时，温火煎30 min，后将药液倒出；另加6倍量水煮沸后开始计时，20 min后合并两次药液，浓缩至生药量为1.0 g/mL。

2.2 溶液配制 分别精密称取安非他酮、奥美拉唑、阿莫地喹标准品12.77、12.07、11.96 mg，置于50 mL容量瓶中，精密量取0.5 mL无水乙醇加入容量瓶中，用生理盐水定容至刻度，混匀，超声，配成0.2 mg/mL的Cocktail混合探针药物溶液。现配现用，给药剂量为1.0 mg/kg。

2.3 内标溶液配制 精密称取格列苯脲标准品4.00 mg置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀，配成400 μg/mL格列苯脲溶液，精密吸取适量，甲醇溶解，涡旋混匀，配成500 ng/mL内标格列苯脲溶液。

2.4 动物给药及血样采集 将32只SD雄性大鼠随机分为4组，每组8只，分别为左归饮高剂量(31 g/kg)、中剂量(20.67 g/kg)、低剂量(13.78 g/kg)组和空白对照组。每天清晨按高、中、低剂量灌胃给予左归饮溶液，空白组每日清晨按200 g/mL给予生理盐水灌胃，连续给药14 d，第14天给药后30 min，每一组均按1.0 mg/kg给药剂量尾静脉注射Cocktail探针药物非那西丁、安非他酮、阿莫地喹混合溶液。在给予大鼠Cocktail探针药物混合溶液后3、5、10、15、30、45 min，1、2、4、6、8 h，分别由眼底静脉丛取血0.2 mL至肝素化离心管中，3 500 r/min离心10 min分离血浆，贮存于-80 ℃冰箱待测。

2.5 血浆样品处理方法 精密量取血浆样品100 μL置于离心管中，加入10 μL内标格列苯脲溶液，再加入300 μL甲醇，涡旋10 min，15 000 r/min离心15 min，取上清液100 μL于进样小瓶中，进样量为2 μL。

2.6 色谱和质谱条件

2.6.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流动相：0.1%甲酸水溶液(A相)-乙腈(B相)；梯度洗脱：0.01～1 min为90% A→20% A，1～1.3 min为20% A，1.3～2.0 min为20% A→5% A,2.0～3.0 min为5% A→10% A，3.0～3.5 min为10% A，3.5～5 min为10% A→90% A；流速为0.2 mL/min；进样量为5 μL；柱温为30 ℃。

2.6.2 质谱条件 离子化方式：电喷雾离子化(ESI)，多反应离子检测(MRM)，正离子模式检测；毛细管电压：3.60 kV；离子源温度：400 ℃；去溶剂化温度：500 ℃；喷雾气为氮气，碰撞气为氩气。安非他酮m/z为240.0/183.9，奥美拉唑m/z为346.1/197.9，阿莫地喹m/z为356.3/283.0，内标格列苯脲m/z为493.9/169.1。

2.7 数据处理 根据不同时间点的探针药物血药浓度，用DAS 2.0软件计算AUC、t1/2、CL等药物代谢动力学参数。应用SPSS 23.0软件进行统计分析，实验组与空白对照组的药物代谢动力学参数比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 方法学验证

3.1 专属性考察 取6只大鼠的空白血浆混合液、Cocktail溶液和内标溶液，混合的空白血浆加入Cocktail溶液、内标溶液，大鼠灌胃左归饮后的血浆样品，大鼠尾静脉注射Cocktail溶液后的血浆样品，按“2.5”项下方法处理样品，采用液质联用仪进行分析。如图1所示，大鼠血浆中内源性物质基本不干扰混合探针底物及内标的检测，大鼠空白血浆添加Cocktail溶液与给药后血样的行为一致。

3.2 线性范围考察 精密吸取大鼠空白血浆100 μL，各加入一系列不同浓度Cocktail溶液10 μL，制备成安非他酮、奥美拉唑、阿莫地喹的系列浓度血浆样品，按“2.5”项下方法处理血浆样品，按“2.6”项下方法进样测定，记录峰面积，以血浆样品标准品浓度(ng/mL)为横坐标(C)，对照品峰面积与内标峰面积之比作为纵坐标(f)，绘制各底物的标准曲线，计算线性回归方程。由实验结果可知，安非他酮线性回归方程为f=0.062 4C+0.207 3(r=0.998 8)，线性范围为5～600 ng/mL；奥美拉唑的线性回归方程为f=0.090 5C+0.173 6(r=0.998 8)，线性范围为5～800 ng/mL；阿莫地喹的线性回归方程为f=0.105 7C+0.066 8(r=0.999 0)，线性范围为0.5～200 ng/mL。

3.3 精密度和准确度考察 以SD大鼠空白血浆进行精密度和准确度(即相对回收率)考察，取适量混合探针底物溶液，配制5份探针底物最低定量下限浓度(lower limit of quantitation, LLOQ)、低浓度(low concentration quality control sample, LQC)、中浓度(middle concentration quality control sample, MQC)、高浓度(high concentration quality control sample, HQC)质控样品，按“2.5”项下方法处理血浆样品，按“2.6.1”项下LC-MS/MS检测方法进样，分别于一日内测定及连续3 d内测定3次，记录峰面积，计算各探针底物峰面积与内标峰面积的比值，代入“3.2”项下标准曲线中求得各探针底物的浓度，计算实际测定量与加入量的比值，进而计算准确度及日内、日间精密度。结果表明，该方法测定探针底物血浆样品的日内及日间精密度均良好，满足生物样品分析要求。

3.4 基质效应考察 取来自不同个体的大鼠空白血浆100 μL，分别加入一系列不同浓度的探针底物混合溶液10 μL，配制成含安非他酮、奥美拉唑、阿莫地喹的LQC、MQC、HQC标准添加SD大鼠的血浆样本，每个浓度平均配制6份，之后按“2.5”项下方法处理血浆样品，按“2.6.1”项下LC-MS/MS方法进样测定，记录安非他酮、奥美拉唑、阿莫地喹的峰面积均为A1。另用100 μL水代替SD大鼠空白血浆，其他步骤同上，记录安非他酮、奥美拉唑、阿莫地喹的峰面积均为A2，则安非他酮、奥美拉唑、阿莫地喹的基质效应均为(A1/A2)×100%。采用相同方式计算内标格列苯脲峰面积并计算其基质效应。由结果可知，探针底物及内标的基质效应均为95%～105%，即离子效应对本方法的测定结果无影响，基本满足底物定量分析的要求。

注：A.空白血浆色谱图；B.空白血浆加探针底物及内标溶液色谱图；C.大鼠尾静脉注射探针底物后探针底物及内标色谱图；Ⅰ.阿莫地喹；Ⅱ.安非他酮；Ⅲ.奥美拉唑；Ⅳ.格列本脲

图1大鼠血浆中探针底物及内标的UPLC-MS/MS图

3.5 稳定性考察 血浆样品稳定性主要利用探针底物LQC、HQC这两个质控样品浓度考察SD大鼠血浆样品的短期稳定性、长期稳定性，其中短期稳定性包括自动进样器稳定性、室温放置稳定性、反复冻融稳定性，自动进样器稳定性考察的是样品在自动进样器中放置24 h的稳定性，而室温放置稳定性考察的是样品在室温条件下放置2 h的稳定性，冻融稳定性主要考察样品冻融3次的稳定性，血浆样品长期稳定性是指血浆样品在-80 ℃冰箱放置20 d的稳定性。在测定安非他酮、奥美拉唑、阿莫地喹这3个储备液稳定性的考察中均表现出稳定性良好，满足生物样品分析条件。

4 药物代谢动力学参数

4.1 探针药物的血药浓度-时间曲线 采用高、中、低剂量左归饮溶液对大鼠灌胃14 d后，按“2.4”项下方法操作，测得3种探针药物的血药浓度并获得血药浓度-时间曲线。

4.1.1 阿莫地喹血药浓度-时间曲线 实验组和空白组大鼠尾静脉注射Cocktail探针药物溶液之后，测得探针药物阿莫地喹的血药浓度，拟合的大鼠体内平均血药浓度-时间曲线见图2。

图2 阿莫地喹在大鼠体内的平均血药浓度-时间曲线

4.1.2 安非他酮的血药浓度-时间曲线 实验组和空白组大鼠尾静脉注射Cocktail探针药物溶液之后，测得探针药物安非他酮的血药浓度，拟合的大鼠体内平均血药浓度-时间曲线见图3。

4.1.3 奥美拉唑的血药浓度-时间曲线 实验组和空白组大鼠尾静脉注射Cocktail探针药物溶液之后，测得探针药物奥美拉唑的血药浓度，拟合的大鼠体内平均血药浓度-时间曲线见图4。

4.2 探针药物的药物代谢动力学参数 各种成分的药物代谢动力学数据经中国药理学会推荐的DAS 2.0程序进行处理、拟合，计算阿莫地喹、安非他酮、奥美拉唑3种探针药物的生物半衰期(biological half life，t1/2)、清除率(clearance，CL)、药-时曲线下面积(area under the curve，AUC)、表观分布容积(apparent volume of distribution，V)等。采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，两组均数比较采用独立样本t检验。

图3 安非他酮在大鼠体内的平均血药浓度-时间曲线

图4 奥美拉唑在大鼠体内的平均血药浓度-时间曲线

4.2.1 左归饮对阿莫地喹在大鼠体内药物代谢动力学参数的影响 阿莫地喹为Cyp2c7酶的特异性探针底物。左归饮高、中、低剂量组与空白组比较，阿莫地喹的主要药物代谢动力学参数的差异均无统计学意义(P>0.05)，提示左归饮高、中、低剂量连续给药对大鼠体内Cyp2c7并无显著的影响。具体药物代谢动力学参数见表1。

表1 左归饮对阿莫地喹在大鼠体内药物代谢动力学参数的影响

4.2.2 左归饮对安非他酮在大鼠体内药物代谢动力学参数的影响 安非他酮为Cyp2b1酶的特异性探针底物。左归饮高、中、低剂量组与空白组比较，安非他酮的主要药物代谢动力学参数的差异无统计学意义(P>0.05)，提示左归饮高、中、低剂量连续给药对大鼠体内Cyp2b1并没有显著的影响。具体药物代谢动力学参数见表2。

4.2.3 左归饮对奥美拉唑在大鼠体内药物代谢动力学参数的影响 奥美拉唑为Cyp2c11酶的特异性探针底物。左归饮高、中、低剂量组与空白组比较，奥美拉唑的主要药物代谢动力学参数的差异均无统计学意义(P>0.05)，提示左归饮高、中、低剂量连续给药对大鼠体内Cyp2c11并无显著的影响。具体的药物代谢动力学参数见表3。

5 讨论

根据《中华人民共和国药典》，左归饮的给药剂量按体表面积折算，大鼠的用药剂量是人类临床用药剂量的6倍，以此计算出大鼠服用左归饮的高、中、低剂量分别为31、20.67、13.78 g/kg。因为在临床上左归饮的给药方式大多为煎服，所以本研究也采用与人体用药方式最接近的灌胃给药。

表2 左归饮对安非他酮在大鼠体内药物代谢动力学参数的影响

表3 左归饮对奥美拉唑在大鼠体内药物代谢动力学参数的影响

左归饮水溶性成分包括多糖、马钱苷、5-羟甲基糠醛、梓醇等[18]。复方左归饮组成中，炙甘草的主要有效成分为甘草酸类及黄酮类化合物，补脾益气，抗疲劳和抗氧化作用更明显。枸杞子的主要化学成分枸杞多糖和甜菜碱，具有补肝益肾的功效。熟地黄中含有地黄苷A、地黄苷D、毛蕊花糖苷3种有效成分，能够补血滋阴、益精填髓。山茱萸总苷有良好的抗炎和免疫抑制作用，熊果酸是山茱萸发挥抑菌作用的有效成分，其和齐墩果酸对链脲霉素造成的糖尿病大鼠有降血糖作用[19]，山茱萸中维生素C、维生素E和硒等有清除自由基和延缓衰老作用[20]。山药中有效成分包含皂苷、多糖、黄酮类物质、尿囊素等。WANG等[21]得出茯苓醇提物中主要含有羊毛甾烷型三萜如茯苓新酸B、茯苓新酸A。

本实验采用Cocktail探针药物法，对大鼠连续给予14 d不同剂量的左归饮后，测定给药组与空白组中阿莫地喹、安非他酮和奥美拉唑在大鼠体内的血药浓度，并计算药物代谢动力学参数，评价左归饮对大鼠细胞色素氧化酶P450不同亚型Cyp2b1、Cyp2c11和Cyp2c7体内代谢活性的影响，为左归饮的开发应用提供实验依据。实验结果表明，与空白组对照，高、中、低剂量的左归饮连续给药对Cyp2b1、Cyp2c7和Cyp2c11酶活性的影响无统计学意义。结果提示，左归饮联合配伍其他药物使用可基本忽略其对代谢酶的影响，这也与左归饮在临床上广泛的配伍应用相一致。