革兰氏阴性菌中β-内酰胺酶诱导表达调控机制研究进展

徐超奕，张婷，蔡静晓，余志良，裘娟萍，音建华



音建华 博士，浙江工业大学生物工程学院副教授，硕士生导师。2013年于浙江大学微生物学专业获博士学位；2013–2015年在浙江大学从事博士后研究。主要从事细菌耐药机制及细胞壁合成调控机制研究，发现了一条独特的β-内酰胺酶诱导表达通路，在和等国际主流期刊以第一作者发表研究论文7篇，主持国家自然科学基金青年项目，担任浙江省微生物学会专业委员会青年委员。

革兰氏阴性菌中β-内酰胺酶诱导表达调控机制研究进展

徐超奕，张婷，蔡静晓，余志良，裘娟萍，音建华

浙江工业大学 生物工程学院，浙江 杭州 310014

徐超奕, 张婷, 蔡静晓, 等. 革兰氏阴性菌中β-内酰胺酶诱导表达调控机制研究进展.生物工程学报, 2018, 34(8): 1288–1296.Xu CY, Zhang T, Cai JX, et al. Progress in regulatory mechanism for inducing β-lactamase in Gram-negative bacteria. Chin J Biotech, 2018, 34(8): 1288–1296.

β-内酰胺类抗生素是应用最广的一类抗菌药物。β-内酰胺酶能将β-内酰胺类抗生素水解，其诱导表达是革兰氏阴性菌对该类抗生素产生耐药性的最主要原因。文中重点综述了革兰氏阴性菌中β-内酰胺酶诱导表达的两种调控机制。在经典的-调控系统中，β-内酰胺酶的诱导表达与肽聚糖循环密切相关，并且LysR型转录因子AmpR发挥核心的调控作用。近年来发现β-内酰胺类抗生素能激活双组分系统，从而诱导β-内酰胺酶的表达。最后，讨论了革兰氏阴性菌中β-内酰胺类耐药今后的研究方向。

革兰氏阴性菌，β-内酰胺类抗生素，β-内酰胺酶，调控机制，双组分系统

β-内酰胺类抗生素 (简称β-内酰胺类，β-lactams) 是临床治疗中应用最悠久且最广泛的一类抗菌药物。该类药物的化学结构中都含有β-内酰胺环，包括青霉素类、头孢菌素类、单环β-内酰胺类、碳青霉烯类和β-内酰胺酶抑制剂等[1]。青霉素结合蛋白 (Penicillin binding protein，PBP) 是细菌中重要的肽聚糖合成酶，负责肽聚糖糖链的聚合和链间的交联。β-内酰胺类能与青霉素结合蛋白不可逆共价结合，从而阻断肽聚糖的生物合成过程，致使细菌裂解死亡[2]。

近年来，由于抗生素的滥用和不合理使用导致细菌耐药性问题日益凸显。世界卫生组织公布了一份亟待研发新抗生素的12种耐药细菌清单，其中半数为β-内酰胺类耐药细菌，尤其是优先度最高的3种细菌均为耐碳青霉烯类的革兰氏阴性杆菌[3]。细菌对β-内酰胺类产生耐药的原因包括：一是修饰或改变抗生素的靶点，革兰氏阳性菌多采用该机制产生耐药性，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin resistant，MRSA) 对β-内酰胺类的抗性即来源于此；二是编码β-内酰胺酶将抗生素水解，这是革兰氏阴性菌中最为普遍的耐药机制；三是减弱细胞外膜通透性，限制抗生素进入细胞内；四是提高药物外排泵的表达，将进入细胞内的抗生素外排[4]。

β-内酰胺酶广泛存在于各种临床致病菌和环境微生物中，根据氨基酸序列一致性可分为A、B、C和D四种类型[5]。其中，A、C和D型均为丝氨酸β-内酰胺酶，而B型为金属β-内酰胺酶。β-内酰胺酶的表达受β-内酰胺类诱导，但由于该类抗生素无法穿越细胞质膜，其如何诱导β-内酰胺酶的表达长期以来备受关注。目前研究最为深入的是部分革兰氏阴性杆菌中C 型β-内酰胺酶AmpC诱导表达的调控，发现其与肽聚糖循环和LysR型转录因子AmpR密切相关。近年来，越来越多的研究表明双组分系统 (Two component system，TCS) 也能调控β-内酰胺酶的表达。本文将结合实验室研究工作，综述这两种β-内酰胺酶诱导表达调控机制，以期为新型抗生素的研发提供新靶点和新思路。

1 经典的ampR-ampC调控系统

C型β-内酰胺酶AmpC (由基因编码) 是一种头孢菌素酶，能够水解青霉素类、头孢菌素类以及单环β-内酰胺类等抗生素[6-7]。AmpC的诱导表达是肠杆菌科细菌 (如阴沟肠杆菌和弗氏柠檬酸杆菌) 以及非发酵革兰氏阴性杆菌 (如铜绿假单胞菌) 对β-内酰胺类产生耐药性的主要原因。对这些细菌的研究表明，AmpC的诱导表达与肽聚糖循环密切相关，并且LysR型转录因子AmpR (由基因编码) 起核心调控作用，这种机制被称为经典的-调控系统[8-10]。

1.1 ampR-ampC divergon

在含有-调控系统的细菌中，与基因在染色体上相邻排列，启动子区域相互重叠，但转录方向相反，即形成divergon结构。基因编码LysR型调控蛋白AmpR，是基因的转录激活因子。AmpR通常具有两个结构域：效应物结合结构域和DNA结合结构域。效应物结合结构域能与不同的效应物或配体结合，从而改变DNA结合结构域的构象，通过与和基因间隔区序列结合，调控两个基因的表达[11]。

1.2 肽聚糖循环过程

细菌在正常生长过程中，肽聚糖始终处于一种动态平衡。在几十种肽聚糖合成酶和水解酶的共同作用下，不断地进行更新和循环[12]。由于β-内酰胺类的靶点是青霉素结合蛋白，抗生素处理时将不可避免地破坏肽聚糖循环的平衡。与β-内酰胺酶诱导表达密切相关的肽聚糖循环酶系主要包括AmpG、AmpD和NagZ[12]。AmpG是位于细胞质膜上的一种通透酶，含有10个跨膜结构域，负责肽聚糖水解产物的转运，如GlcNAc-anhMurNAc和GlcNAc-anhMurNAc-peptides等[13-14]。AmpD和NagZ均位于细胞质中，其中AmpD为N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶 (N-acetylmuramyl-L-Ala amidase)，能迅速水解anhMurNAc和L-Ala之间的酰胺键；而NagZ是β-乙酰氨基葡糖糖苷酶 (β-N-acetylglucosaminidase)，负责切开GlcNAc和anhMurNAc之间的β-1,4糖苷键[15]。AmpD和NagZ的共同作用可将细胞质中的肽聚糖水解产物进一步生成GlcNAc、anhMurNAc以及anhMurNAc-peptides (图1)。

1.3 AmpG-AmpD-NagZ-AmpR调控通路

在缺乏β-内酰胺类诱导物时，由于AmpD和NagZ的作用使细胞内anhMurNac-peptides始终维持在较低的浓度，而三肽L-Ala-D-Glu--Dap含量较高，进一步催化后生成UDP-MurNAc- pentapeptide。UDP-MurNAc-pentapeptide可作为阻遏信号分子与AmpR结合，从而抑制基因的转录。当诱导物存在时，细胞周质空间中肽聚糖的损伤导致进入细胞质的肽聚糖水解产物大幅度增加，AmpD达到饱和状态，anhMurNAc-peptides大量积累，并作为诱导信号分子与UDP-MurNAc- pentapeptide竞争结合AmpR，引起AmpR蛋白构象的变化，从而激活基因的转录 (图1)[11]。

AmpG-AmpD-NagZ-AmpR调控通路中任一基因的突变都有可能影响基因的诱导表达。基因的缺失阻断了anhMurNac-peptides的水解，使得诱导信号分子始终处于高浓度，引起AmpC高表达，致使很多临床菌株对β-内酰胺类产生耐药性[16-17]。中共有3个AmpD同源蛋白，它们的依次失活能引起AmpC表达水平和细菌耐药程度逐级增加[18-20]。AmpG的失活使诱导信号分子前体无法进入细胞质，导致基因的表达不再被诱导[21-22]。NagZ可催化诱导信号分子的产生，因此基因突变与效果一致，均能阻断基因的表达。AmpG和NagZ的失活还能显著降低因基因突变引起的AmpC高表达[23]。

图1 AmpR介导的β-内酰胺酶诱导表达调控模式图

这种经典的-调控系统同样适用于目前所研究的其他类型β-内酰胺酶的诱导表达，如霍乱弧菌中B型β-内酰胺酶VanG[24]、野油菜黄单胞菌中A型β-内酰胺酶Blaxc[25-26]以及嗜麦芽窄食单胞菌中A型β-内酰胺酶L2 (BlaL2) 和B型β-内酰胺酶L1 (BlaL1)[27-29]。中基因和基因构成divergon，但AmpR可同时激活L1/L2的表达。此外，该菌中基因 (编码PBP1a) 的失活致使这两个β-内酰胺酶呈组成型高表达，并且该过程依赖于AmpG-AmpD-AmpR，但不依赖于NagZ，表明L1/L2的表达除了遵循经典的-调控系统外，还存在一条不依赖于NagZ的调控通路[30-33]。

1.4 肽聚糖水解酶对β-内酰胺酶表达的影响

正是由于肽聚糖循环与AmpC表达密切相关，细胞周质空间中肽聚糖的细微变化都有可能影响β-内酰胺酶的表达。目前已经发现部分肽聚糖水解酶与β-内酰胺酶的表达调控有关，如溶菌糖基转移酶 (Lytic transglycosylases，LTs) 和低分子量PBP等。通常，这些肽聚糖水解酶在细菌中数量较多，并且功能冗余，它们对β-内酰胺酶表达的影响在不同细菌中存在差异。LTs能将GlcNAc和MurNAc之间的β-1,4糖苷键切开，释放-调控系统中的诱导信号分子前体GlcNAc-1,6-anhMurNAc peptides。因此，LTs的失活势必影响β-内酰胺酶的表达。中含有11个LTs，但只有SltB1和MltB的失活增强AmpC的表达，而SltB的失活降低AmpC的表达[34-35]。中含有6个LTs，MltD1的失活通过上调其他LTs (MltB1和MltD2) 的表达增强L1/L2本底水平的表达，该过程依赖于AmpG-AmpD-NagZ-AmpR通路以及双组分系统CreBC[36]。低分子量PBP具有DD-羧肽酶和/或内肽酶活性，负责肽聚糖的修饰。中PBP4的突变使β-内酰胺酶AmpC以依赖于AmpR的方式过表达，显著增强对β-内酰胺类的耐药性[37-38]。

2 双组分系统介导的β-内酰胺酶诱导表达

双组分系统是微生物中广泛存在的基因表达调控系统。该系统高度保守，一般由组氨酸激酶 (Histidine kinase) 和反应调节蛋白 (Response regulator) 二元组分构成。组氨酸激酶属跨膜蛋白，其N末端能够感知外界信号，催化C末端保守的组氨酸残基自磷酸化；然后将磷酰基转移至位于细胞内的反应调节蛋白，保守的天冬氨酸残基发生磷酸化，从而激活或抑制基因的表达，使微生物适应不同的环境变化[39]。组氨酸激酶感知的信号多种多样，如渗透压、细胞膜损伤、细胞壁损伤、金属离子和抗生素等；反应调节蛋白调控的生命过程也多种多样，如维持稳态、毒力响应、呼吸转换以及抗生素耐药等。

2.1 气单胞菌中β-内酰胺酶表达的调控

气单胞菌属中的BlrAB是第一个被发现直接调控β-内酰胺酶表达的双组分系统。属细菌通常编码三种可诱导型β-内酰胺酶：B型CphA (也称Imi)、C型Cep和D型Amp[40-41]。对模式菌株嗜水气单胞菌的研究发现，编码双组分系统的基因位于β-内酰胺酶基因的上游，其中编码反应调控蛋白BlrA，而编码组氨酸激酶BlrB。β-内酰胺类诱导物抑制PBP的活性，致使肽聚糖平衡紊乱，二糖五肽单元 (GlcNAc-MurNAc-pentapeptide) 含量增加，很有可能作为信号分子通过直接或间接作用使BlrB自磷酸化；随后，磷酸基团转移至BlrA，激活的BlrA与特异的识别标签(cre/blr-tag：TTCACnnnnnnTTCAC) 结合，从而募集RNA聚合酶启动β-内酰胺酶的表达[42](图2)。三个β-内酰胺酶基因的上游均存在该特异标签，并且标签的重复次数与β-内酰胺酶的表达水平呈正相关。、和基因前的标签数分别为1、2、3个，β-内酰胺酶的表达水平为ImiH>CepH>AmpH[41,43-44]。BlrB感知的信号源自于肽聚糖损伤，DD-羧肽酶/内肽酶 (PBP4和BlrY) 的失活显著提高二糖五肽单元含量，增强β-内酰胺酶的表达 (图2)；而万古霉素能与D-Ala-D-Ala特异性结合，处理细菌后β-内酰胺酶的表达受到抑制。另外，基因下游含有一个编码内膜蛋白的基因，其转录受BlrAB控制，但BlrD在β-内酰胺酶表达中的作用尚不清楚[44]。

图2 双组分系统介导的β-内酰胺酶表达调控示意图

大肠杆菌中的双组分系统CreBC与BlrAB高度同源，最初发现CreBC是中间代谢的全局调控因子[43,45]。反应调节蛋白CreB识别的特异序列与BlrA一致，当属来源的3个β-内酰胺酶基因连同上游序列一起转入DH5α菌株 (CreB+) 时，β-内酰胺酶可被成功表达[43]。

和中的CreBC可能参与β-内酰胺酶表达的调控。中PBP4的突变特异性激活CreBC，然后上调CreD (与BlrD同源) 的表达，间接参与β-内酰胺酶的表达[37,46]。此外，CreBC还在β-内酰胺类胁迫、生物膜形成以及细菌适应度方面发挥重要的作用[46]。中CreBC与细菌运动性密切相关[47]，MltD1失活导致的β-内酰胺酶表达同时需要CreBC和AmpR的参与[36]。

2.2 弧菌中β-内酰胺酶表达的调控

副溶血性弧菌是一种重要的食源性致病菌，其对青霉素类的耐药性主要由A型β-内酰胺酶 (V100) 介导[48]。该菌中含有32个可能的双组分系统，但只有VbrKR缺失后显著降低β-内酰胺酶的表达和β-内酰胺类耐药性。VbrK是一种能直接感知β-内酰胺类的组氨酸激酶，抗生素的结合使其空间构象发生变化，组氨酸激酶结构域与ATP酶结构域之间更加接近，随后VbrK自磷酸化并将磷酸基团转移至反应调节蛋白VbrR，从而触发β-内酰胺酶的表达[49](图2)。有趣的是，VbrKR还能调控PBP1a和PBP3的表达，但是否与β-内酰胺酶表达相关尚不清楚。

与BlrAB/CreBC明显不同的是，VbrK感知的信号并非来自于肽聚糖的损伤，而是直接与抗生素结合，然后迅速将信号传递至细胞内，通过诱导β-内酰胺酶的表达保证在细胞裂解之前将抗生素水解[50]。VbrK是目前革兰氏阴性菌中唯一发现能直接感知β-内酰胺类的受体蛋白。几乎所有弧菌属细菌都编码与VbrK同源的组氨酸激酶，因此弧菌属可能普遍存在VbrK介导的β-内酰胺酶表达调控机制。革兰氏阳性菌中β-内酰胺酶 (如BlaP和BlaZ) 的诱导表达也起始于抗生素与膜受体蛋白之间的直接相互作用，但受体蛋白感知抗生素后自身变成有活性的金属蛋白酶，通过水解阻遏蛋白诱导β-内酰胺酶的表达[51]。

2.3 希瓦氏菌中β-内酰胺酶表达的调控

水环境中广泛存在的希瓦氏菌属被认为是β-内酰胺类和喹诺酮类耐药基因的天然存储库，部分菌株也逐渐成为新兴致病菌[52-53]。该属的模式菌株奥奈达希瓦氏菌编码7个假定的β-内酰胺酶，其中由染色体介导的D型β-内酰胺酶BlaA (也称为OXA-54) 可能是碳青霉烯类水解酶Oxacillinase的祖先[54]。笔者近年来的研究发现，该酶的表达受氨苄青霉素诱导，但具体的诱导机制与AmpR介导的调控系统差异显著，主要表现在两个方面：一是基因组中基因未与其他调控蛋白基因构成divergon，也不含有与AmpR高度同源的调控蛋白；二是主要的肽聚糖循环酶 (如AmpG、NagZ和AmpD) 对表达的影响与经典的-调控系统相反[55-57]。和基因缺失后基因的表达仍可被诱导，表明该菌中存在一条不依赖于AmpG-NagZ-AmpR的β-内酰胺酶诱导表达通路。该通路与PBP1a及其外膜脂蛋白辅因子LpoA有关，这两个蛋白形成肽聚糖合成酶复合体PBP1a-LpoA，其失活导致基因呈组成型高表达，暗示诱导表达的信号分子位于周质空间。中含有数目众多的双组分系统，虽不与CreBC或VbrKR高度同源，但有证据表明其他双组分系统参与表达的调控。PBP1a与周质空间中的β-内酰胺类共价结合而失活，致使细胞被膜受损，激活双组分系统，从而诱导β-内酰胺酶的表达[58-60]。

3 结论与展望

由此可见，革兰氏阴性菌中β-内酰胺酶诱导表达调控机制具有以下共同特点：LysR型转录因子或双组分系统在调控中起核心作用；如果β-内酰胺酶基因与LysR型转录因子编码基因组成divergon，那么该β-内酰胺酶的表达受LysR型转录因子调控；同一物种中可能同时包含两种调控通路 (如和)，二者之间存在相互影响；肽聚糖循环在β-内酰胺酶诱导表达过程中发挥重要的作用，除VbrKR直接感知抗生素外，其他已经发现的调控蛋白均感知肽聚糖水解片段。

由于肽聚糖生物合成和循环过程非常复杂，目前我们对诱导β-内酰胺酶表达的信号分子仍不清晰，尤其是抗生素作用对肽聚糖的具体影响缺乏详实数据。未来的研究应该从以下几个方面展开：1) 继续研究不同细菌中β-内酰胺酶诱导表达的调控机制，尤其是重要的临床致病菌和环境微生物。CRISPR-Cas9基因编辑技术的发展使得这些细菌的遗传改造变得方便快捷。2) 利用生物信息学工具，从数据库中挖掘β-内酰胺酶诱导表达调控相关元件的分布规律，在进化层面上明确抗性基因的来源和转移规律。3) 已有报道表明NagZ抑制剂能有效降低AmpC高产菌株对β-内酰胺类的耐药性[23]，接下来应针对β-内酰胺酶诱导表达通路中的新靶点，加大筛选特异性药物的力度，从而有效解决革兰氏阴性菌中的β-内酰胺类耐药问题。

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(本文责编 陈宏宇)

Progress in regulatory mechanism for inducing β-lactamase in Gram-negative bacteria

Chaoyi Xu, Ting Zhang, Jingxiao Cai, Zhiliang Yu, Juanping Qiu, and Jianhua Yin

College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, Zhejiang, China

Beta-lactams are the most widely used antibiotics. One of the principle mechanisms for Gram-negative bacteria to resist β-lactams is by producing β-lactamases that degrade β-lactams. This review highlights two regulatory mechanisms for inducing β-lactamase in Gram-negative bacteria. In the-paradigm, the induction of β-lactamase is intimately linked to peptidoglycan recycling. AmpR, a LysR-type transcriptional regulator, plays a central role in regulating expression of β-lactamase. Recent studies found that two-componentsignal transduction pathway is activated by β-lactams, which in turn induces the expression of β-lactamase. Finally, we discussed the future research directions in β-lactam resistance in Gram-negative bacteria.

Gram-negative bacteria, β-lactam antibiotics, β-lactamase, regulatory mechanism, two-component system

May 4, 2018;

June 11, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 31600041).

Jianhua Yin. Tel/Fax: +86-571-88320057; E-mail: jianhuay@zjut.edu.cn

国家自然科学基金 (No. 31600041) 资助。

2018-07-02

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180629.1800.001.html

10.13345/j.cjb.180187