多重荧光RT-PCR快速检测手足口病病原体的结果分析

沈伟锋 邵平扬 殷新光 邹洪兴 吕青山 杨清萍

根据世界卫生组织调查，手足口病（HFMD）已成为亚洲最常发生的传染病之一，＜5岁儿童是主要患者。因其传染性强、病死率高，已经连续5年成为我国发病率最高的传染病之一。2015年12月，国家食品药品监管总局批准了首个EV71型灭活疫苗的生产注册申请，并于2016年3月18日正式上市［1］。临床试验显示，EV71疫苗对EV71感染HFMD的保护效力＞90%，但受样本数量限制，对EV71感染所致重症病例的保护效力以及免疫的持久性等缺乏准确评估，对CA16感染和其他肠道病毒感染的HFMD无保护作用［2-3］。因此，HFMD疫情的防控任务依然严峻，对HFMD病原体快速检测及分型有利于HFMD的早期诊断和治疗，也是危重病例救治的关键。本研究采用自建的多重荧光RT-PCR方法对HFMD患者肠道病毒进行分型检测，并对2017年嘉兴地区HFMD的病原学类型及流行特征进行分析。现报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料 收集2017年1月至12月嘉兴市第一医院感染科就诊的HFMD患儿743例，其中男435例，女308例；年龄4个月～13岁，中位年龄34个月，HFMD临床诊断标准依据卫生部颁布的《HFMD诊疗指南》（2010年版）［4］。HFMD纳入标准：（1）临床症状表现为手、足、口腔等部位的斑丘疹、疱疹，伴或不伴发热。（2）病程1～5d初次就诊，未经抗病毒治疗的急性期患儿。（3）肠道病毒通用型（EV）核酸检测阳性。（4）重症病例出现神经系统受累症状，表现为精神差、嗜睡、易惊、头痛、呕吐、谵妄、昏迷、肢体抖动、肌阵挛、眼球震颤、共济失调、眼球运动障碍、无力或急性弛缓性麻痹、惊厥等，体格检查可见脑膜刺激征、腱反射减弱或消失，巴宾斯等病理征阳性［4］。

1.2 方法 （1）标本采集与处理：每例患者均留取急性期咽拭子样本1份，用病毒专用采样管采集，-70℃低温保存，用于肠道病毒核酸检测。（2）仪器与试剂：GenBank数据库中下载不同年份和地区EV的5’端非编码区基因序列、EV71和CA16的VP1区基因序列，引物与探针委托上海基康生物工程有限公司合成；荧光定量PCR仪为美国AB公司ABI7500。病毒RNA提取试剂Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit购自德国Qiagen公司；Real Time PCR Kit购自TIANGEN，严格按照试剂盒说明书操作提取病毒RNA。（3）肠道病毒核酸检测：采用课题组建立的多重荧光RT-PCR方法对HFMD患者肠道病毒进行分型检测［5］，每份标本同时进行肠道病毒通用型、肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CA16）核酸及非竞争性内标检测。PCR扩增反应条件为：50℃20min，1个循环；95℃15min，1个循环；94℃ 15s，56℃45s，45个循环。在每个循环退火温度时进行荧光采集，共选用FAM、ROX、VIC和CY5四通道进行检测。（4）多重荧光RT-PCR检测结果分析：课题组建立多重荧光RTPCR方法，由于引入了非竞争性内标检测，可监测标本检测的假阴性反应，为临床HFMD样本检测的准确性提供了保证。根据PCR检测的原理，将Ct≤38判断为阳性结果；内标CY5通道出现特异性扩增荧光信号，则该标本检测结果有效。判断EV71或CA16阳性必须同时EV阳性。结果解释参照《HFMD预防控制指南》（2008 年版）［6］。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计数资料组间比较采用χ2检验，p＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR检测肠道病毒EV71型和CA16型核酸结果 743例HFMD患者中，EV71型肠道病毒感染176例，占23.7%；CA16型肠道病毒感染155例，占20.8%；非EV71非CA16型肠道病毒感染410例，占55.2%；EV71/CA16混合感染型2例，占0.3%。743例HFMD患者中，重症HFMD患者114例，占15.3%，普通HFMD患者629例，占84.7%；重症HFMD组以肠道病毒EV71型感染为主，占78.1%（89/114），而普通HFMD组肠道病毒EV71型感染仅占13.8%（87/629），两组之间不同类型肠道病毒感染人数构成比，差异具有统计学意义（χ2=235.939，P=0.00）。见表1。

表1 重症HFMD与普通HFMD患者肠道病毒核酸检测结果［n（%）］

2.2 743例HFMD患者病原体感染季节分布 2017年1～12月共采集到EV阳性的HFMD病例743例，不同季度感染分布不一，其中二、三季度为全年发病高峰期，肠道病毒检出率达81.0%，尤以二季度肠道病毒感染检出率最高，占全年的52.2%；非CV71非CA16型EV阳性病例在全年各季度的检出率均高于CV71型和CA16型。HFMD在不同季节之间，不同类型肠道病毒感染的人数分布比较，差异无统计学意义（χ2=18.159，P=0.033）。见表 2。

表2 743例HFMD患者不同肠道病毒感染时间分布及分型结果（n）

2.3 不同性别间HFMD患儿感染不同肠道病毒的构成比 743例HFMD患儿中，不同性别感染不同类型肠道病毒的人数分布见表3。经统计学分析，被不同类型肠道病毒感染的人数分布在性别之间，差异无统计学意义（χ2=0.602，P=0.896）。

表3 743例HFMD患儿肠道病毒感染性别分布［n（%）］

2.4 HFMD患者病原体感染年龄分布 743例HFMD患儿中，0～5岁感染儿童占88.6%，≥6岁感染儿童占11.4%。HFMD患者不同肠道病毒类型年龄分布见表5。

表 5 743例HFMD患者病原体感染年龄分布（n）

3 讨论

HFMD是儿童常见传染病，由多种肠道病毒感染引起，临床症状表现轻重不同，大多数患儿症状轻微，预后良好；少数重症病例可并发病毒性脑炎、急性弛缓性麻痹、神经源性肺水肿、心肌炎，甚至危及生命。对HFMD病原体快速检测及分型有利于HFMD的早期诊断和治疗，也是危重病例救治的关键［7］。目前，HFMD病原学的实验诊断方法主要有免疫学方法进行肠道病毒特异性抗体检测和荧光RT-PCR进行病毒核酸检测，前者因方法学的局限性，仅限于肠道病毒EV71、CA16分型，且易出现假阳性结果，无法对非EV71非CA16型肠道病毒的分型鉴定和早期诊断。实时荧光RT-PCR法因具有较高的灵敏度和特异性，已成为HFMD病原学分型检测的金标准［8］，但临床实际工作中因标本采集、污染、RNA抑制物等因素，无法检测结果的假阴性，且对于大批量标本的检测费时费力。本研究采用含非竞争性内标检测的多重荧光RTPCR方法，能够一管同时检测肠道病毒通用型、EV71型和CA16型，并对假阴性结果进行有效的监控，弥补了其他方法学的不足。

本资料中743例HFMD患儿，EV71型肠道病毒感染176例，占23.7%，CA16型感染155例，占20.9%，EV71型与CA16型混合感染2例，占0.3%，其余410例HFMD为非EV71非CA16型肠道病毒感染，占55.1%，提示本地区HFMD病原体感染流行毒株可能存在多样性，或有其他肠道病毒的感染流行毒株，有必要进一步明确非EV71非CA16型肠道病毒的类型，并加强监控。114例重症HFMD患者中，EV71型、CA16型和非EV71非CA16型肠道病毒所占比例分别是78.1%，9.6%和10.5%；629例普通HFMD患者中EV71型、CA16型和非EV71非CA16型的肠道病毒所占比例分别是13.8%，22.9%和63.3%，可见EV71型肠道病毒在HFMD重症病例中仍占主导优势，但临床亦不可忽视非EV71非CA16型的其他肠道病毒在HFMD患儿，尤其是重症病例中的检出情况。

随着EV71型灭活疫苗的批准上市和临床应用以及国家对HFMD控制与预防工作的宣传与干预，各地HFMD的流行特征亦发生演变，部分地区非EV71非CA16型肠道病毒感染比例逐年上升。本资料在总结2017年HFMD患儿流性特征的基础上，发现HFMD非EV71非CA16型肠道病毒感染占较高比例，达到55.1%。进一步比较分析743例HFMD患儿的临床分布，发现本地区HFMD各季度感染分布不一，流行特征表现为夏秋两季高发，HFMD发病人数占全年的81.0%，非CV71非CA16型肠道病毒感染病例的检出率均高于CV71型和CA16型，可能存在其他肠道病毒优势型别，需引起重视；743例HFMD患儿中，不同类型肠道病毒感染的人数分布，在性别上无差异，表明不论性别，HFMD的发病概率相似；对HFMD发病患儿年龄分布特征分析发现，HFMD发病以婴幼儿（＜6岁）为主，占88.6%，符合HFMD的流行特征。

综上所述，HFMD作为一种高发幼儿传染病，嘉兴地区EV71型肠道病毒仍然是重症HFMD的主要流行毒株，但HFMD的肠道病毒感染流行特征不一，临床亦不可忽视HFMD非EV71非CA16型肠道病毒感染流行的监控，有必要进一步明确类型，为临床诊疗与疾病防控提供信息。