母婴分离方法制备产后抑郁大鼠模型的行为学及海马病理变化的观察

李净娅 章正祥⋆ 戚观树 杨歆科

产后抑郁症（PPD）是指产妇在分娩后出现情绪低落，精神抑郁为主要症状的病症［1］。PPD动物模型单一，Galea等［2］于2001年制备的激素撤离模型是迄今唯一的较为成熟的PPD模型。2007年，Boccia Maria L等［3］发现产后被长时间母婴分离的母鼠在强迫游泳实验中有类似抑郁症状的表现。随后其他一些研究亦证明了这一现象，并且抑郁症状在分离后数周仍持续存在。而Toigo EP［4］则以类似方法造模，强迫游泳结果亦显示，在产后35d母婴分离的母鼠不动时间延长，并发现其海马内钠钾ATP酶活性增强，一氧化氮含量下降。有研究［5］显示暴露在压力环境下，钠、钾ATP酶活性只会持续增强数小时，而持续性的钠、钾ATP酶活性降低是抑郁证的一个重要指征，其活性可被抗抑郁药如弗洛西汀和西斯帕明改善。诸多研究均指示母婴分离可能是一个较好的，单纯社会因素造模的产后抑郁模型。但是目前关于母婴分离PPD模型的研究国外多局限于行为学的观察，且在国内尚属空白领域。本研究目的旨在观察母婴分离母鼠海马的病理结构的改变以及与各行为学实验的评价结果，为母婴分离PPD模型的制备提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康SD雌性大鼠，孕期16～17d，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2012-0001。

1.2 实验仪器 大鼠场箱：高40cm、长80cm、宽80cm，内空，箱壁四周黑色，底面用黑线均匀划分为相等面积的25块方格；高架十字迷宫架：由相对开放臂（50cm×l0cm）和两条相对闭合臂（50cm×40cm×10cm）以及中央区（10cm×l0cm）连接而成，材质采用高级医用有机板制作，接触面不反光，可使用酒精清洗除味；以上两者均由北京中医药大学基础医学院诊断教研室提供；强迫游泳水缸：直径25cm、高度60cm、水深35 cm 的圆柱形筒。自制悬尾箱［6］：高60cm、长100cm、宽60cm，硬纸板五面封闭，朝天花板的一面的正中有小孔，便于固定大鼠尾部，朝向观察者的一面开放；Finesse 325 型旋转石蜡切片机：赛默飞世尔（上海）仪器有限公司；倒置式生物显微镜：日本奥林巴斯公司（CKX41S）；图像采集系统：日本尼康公司（Digital Sight DS-U2）。

1.3 实验方法 购入20只大鼠，对其进行编号（标号为1～20号），适应性喂养，待产。随机选取16只大鼠，将生产当天记为Day0，于Day1-Day14的每天9：00将母鼠拿出饲养笼单独置于分离笼内，笼内正常放置食物和水，乳鼠被留在原饲养笼内。分离时段内放置母鼠的分离笼与原饲养笼共置一室，使母鼠可以嗅到乳鼠气味，听到乳鼠声音。其余4只产后大鼠（标号为1、2、12和17号）作为空白对照，与乳鼠不作任何分离，其他时间段无关人员不得接近饲养笼，以免干扰动物。于第14天分离结束后对20只母鼠行旷场实验评价，根据旷场水平得分、垂直得分、旷场移动平均速度、旷场移动总路程和中央区停留时间为因子采用K-聚类分析进行分类。母鼠于第21天再次进行各行为学实验观察（包括旷场实验、强迫游泳实验、悬尾实验、高架十字迷宫实验），于第50天取大脑海马观察HE染色结果。

1.4 观察方法 （1）行为学观察：旷场试验（OFT）：于隔音的光亮环境下，测试前保持敞箱内洁净，每只大鼠测5min，记录水平活动与垂直活动得分：水平活动得分：动物穿越方格数（大鼠四肢均进入方格内为准）；垂直活动得分：大鼠直立次数，以大鼠的两前肢离地计为1次。强迫游泳测试（FST）：将各组大鼠在安静状态下分别进行预游泳 15min（水温24℃～25℃）。结束后，用毛巾将鼠毛擦干，置于28℃的环境中 30min 后放回鼠笼。24h后进行正式游泳，在同一时间、同样条件下重复游泳 5min，并以秒（s）为单位记录5min内大鼠所呈现的不动（直立漂浮状态）和挣扎（四肢攀爬缸壁）状态。悬尾实验（TST）：在暗光、无噪声的环境下进行，操作者握住大鼠的尾巴根部1/ 3处，将大鼠头部向下，固定在大鼠悬尾箱内，采用双盲法观察3min。记录：①不动时间：指大鼠处于完全放松静止不动状态的累积时间；②挣扎次数：指大鼠由倒挂向上翻转的总次数。高架十字迷宫实验（EPM）：将大鼠置于迷宫中央，头朝开臂，观察者距离迷宫中心≥1m。记录5min内大鼠进入开臂和闭臂的次数和在两臂滞留时间（以四肢全部入臂为准）。计算大鼠进入开臂次数和在开臂滞留时间分别占总次数（进入开臂和闭臂次数之和）和总时间（在开臂与闭臂滞留时间之和）的百分比（即OE%和OT%）。每次实验完成后将大鼠取出，清理两臂并喷洒酒精除去气味。（2）脑组织病理形态观察：于第50天即造模结束1个月后将20只母鼠，予 10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.4ml /100g），断头取脑，放入盛有4%的福尔马林固定液中固定2周后，常规脱水、透明、石腊包埋、切片（6μm）。常规HE染色。光镜下观察大脑海马组织神经细胞结构，并摄片。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以（）表示，组间比较采用t检验。p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 分组结果 根据旷场水平得分、垂直得分、旷场移动平均速度、旷场移动总路程和中央区停留时间为因子采用K-聚类分析分出2组：一组包括9只，鼠号为：12，14，9，2，17，18，13，16，1号，其中全部 4只空白对照大鼠（鼠号1，2，12和17号）均在组1，故定为正常组；另一组包括11只，鼠号为：3，5，4，7，20，8，10，15，19，11，6 号，定为 PPD 组。

2.2 两组大鼠在造模后1周时点的行为学观察结果 产后抑郁组体重变化程度明显高于正常组，并且水平及垂直分数明显较正常组降低。产后抑郁组悬尾实验中不动时间明显增加（p＜0.01），强迫游泳不动时间也有延长趋势，但尚未达到统计学意义。在十字迷宫测试中，与正常组比较，产后抑郁组大鼠在闭臂停留时间明显增加，在开臂停留时间明显减少，并且进入开臂闭臂总次数也明显降低（p＜0.01）。见表1。

2.3 两组大鼠在造模后第4周时点的脑组织病理形态结果 正常组海马神经元细胞数量多，结构完整，排列整齐，胞浆丰富饱满，胞核染色清晰均一。模型组在造模结束第4周的HE染色结果显示，海马细胞数量明显减少，细胞间隙大，排列较空白组疏松，细胞淡染，着色不均，细胞核固缩明显。见图1～4。

表1 两组大鼠在造模后1周时点的行为学观察结果（x±s）

图1 PPD组大鼠海马HE染色（100×）

图2 PPD组大鼠海马HE染色（400×）

图3 正常组大鼠海马HE染色（100×）

图4 正常组大鼠海马HE染色（400×）

3 讨论

产后抑郁发病原因由内在生物变化因素和社会因素导致。众多研究［7-8］已经表明，产后雌、孕激素的撤退是导致产后抑郁发生的一个重要因素，Galea等［2］根据这一原理制备产后抑郁大鼠模型，通过激素模拟大鼠怀孕时的体内激素状态，发现大鼠在激素撤退第2天，强迫游泳实验不动时间延长。至今为止激素撤离产后抑郁模型是唯一公认的较为成熟的模型。

但是与生物学因素比较，社会因素在人类产后抑郁发病因素中起着同等重要的地位。相对于通过模拟大鼠的产前、产后体内激素变化状态来制备产后抑郁模型，考虑是否可以通过模拟人类社会因素成功制备产后抑郁模型。临床上显示新生儿在监护室育养而导致母婴分离的产妇得抑郁症概率增加［9］。随后有研究显示，母婴分离3h/d的母鼠有抑郁表现且钠钾离子通道改变［5］。本研究对新产大鼠进行母婴分离后，将20只大鼠（包括4只未分离大鼠）造模结束时OFT的水平分数、垂直分数、中央区停留次数、中央区停留时间、平均移动速度五个指标为因子聚类分析后发现，20只大鼠可以分为两组，产后抑郁组（11只），正常组（9只，包括未分离大鼠4只），由此计算出68.75%的母婴分离母鼠有明显的抑郁表现。随后通过进一步对造模结束1周后两组各行为学评分进行比较，结果显示两组OFT、TST、EPM指标均有差异，产后抑郁组较正常组体重波动明显，并且在造模结束4周后海马HE染色仍有神经元受损的表现。旷场试验是抑郁大鼠行为学观测常用的方法，水平分数降低代表大鼠的行动能力下降，垂直分数的降低代表探索能力的下降，同时在强迫游泳与悬尾实验中不动时间增加意味抑郁大鼠的绝望程度。而EPM实验的阳性结果则提示，经过母婴分离的母鼠不仅有抑郁的表现，还有焦虑的表现，这也与临床中产后抑郁与焦虑常合并的现象吻合。并且不少实验研究［10］均已发现抑郁大鼠海马神经元减少，细胞核固缩，这也与本实验结果契合。以上结果均说明母婴分离可能是一个较好的能模拟抑郁核心症状以及病理表现的产后抑郁模型。

然而由于仍有一些大鼠抑郁表现并不明显，此方法仍需要进一步改进，将分离2周延长至3周，每天的分离时间亦延长至4h，分离3周后继续单笼饲养可能会增加模型的成功率。因此关于此模型有必要进一步的探索实验。