HPLC-DAD同时检测饲用植物提取物中非法添加喹乙醇和乙酰甲喹的含量

2018-08-27刘发全宋亚伟丁在亮

安徽农业科学 2018年24期

吴昊，刘发全，宋亚伟，丁在亮

(安徽省兽药饲料监察所，安徽合肥 230091)

饲用植物提取物是采用适当的溶剂或方法，从植物全部或者某一部分为原料提取或加工而成，具有一种或多种生物学功能[1]，添加在动物饲料中能起到促进生长、抗菌、抗病毒、增加动物免疫力、增强肉品风味和动物采食量等作用的活性物质，是理想的饲用抗生素替代品[2-3]。喹乙醇、乙酰甲喹属于喹噁啉类合成抗菌药，对革兰氏阴性菌有很强的杀菌力，特别对致病性溶血性大肠杆菌敏感性最高，添加在饲料中具有明显的抗菌和促生长作用，可促进蛋白质同化，提高饲料转化率与瘦肉率，研究发现其具有蓄积毒性和致突变性[4-5]。

农业部第2638号公告发文禁止在饲料中添加喹乙醇、乙酰甲喹，但因其效果好，价格便宜，外观为淡黄色粉末，常被不法分子非法添加进植物提取物中制成“伪饲料用植物提取物”，这不仅扰乱正常饲用植物提取物市场，而且因药物残留会引起食品安全事件，目前针对饲用植物提取物中非法添加喹乙醇、乙酰甲喹的检测方法鲜见报道。笔者结合饲料中非法添加的特点，建立了准确、简便、快速的HPLC-DAD检测方法，为饲用植物提取物中非法添加喹乙醇、乙酰甲喹检测提供参考。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要仪器。美国Agilent公司高效液相色谱仪，型号HP 1260，配四联梯度泵、在线脱气机、二极管阵列紫外检测器(DAD)、自动进样器和柱温箱；十万分之一电子天平，德国赛多利斯，感量0.01 mg，型号CPA225D；超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.1.2主要试剂。喹乙醇对照品(批号H0061103，含量99.5%)、乙酰甲喹对照品(批号H0070808，含量99.3%)，均购自中国兽医药品监察所；饲用植物提取物(A样)；乙腈、甲醇均为色谱纯，美国FISHER Chemical公司；N，N二甲基甲酰胺、磷酸均为分析纯，上海试剂公司；水，水质符合实验室一级用水的规定。

1.2方法

1.2.1对照品溶液的制备。精密称取喹乙醇50.58 mg、乙酰甲喹50.70 mg对照品于100 mL棕色容量瓶，加N，N二甲基甲酰胺10 mL溶解，加甲醇定溶，制成储备液，分别精密量取喹乙醇、乙酰甲喹储备液5 mL于50 mL棕色容量瓶混合，加甲醇定溶，制成工作液。

1.2.2供试品溶液的制备。称取饲用植物提取物试样2 g，精确至0.000 1 g，置于100 mL容量瓶中，用90%甲醇溶液准确定容，振荡提取30 min，将试样提取液转移至离心管，以3 000 r/min离心10 min，取离心上清液用0.45 μm尼龙滤膜过滤，取续滤液，即得。

1.2.3色谱分析条件。色谱柱：Agilent公司ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：甲醇-磷酸溶液(0.025 mol/L，用三乙胺调节pH=6.0)，按体积比20∶80(V/V)为流动相，流速为1.0 mL/min，200～400 nm波长扫描，测定波长为260 nm，柱温40 ℃，进样量10 μL。

1.2.4方法学考察。

1.2.4.1系统适用性试验。分别吸取对照品溶液及供试品溶液各10 μL，在“1.2.3”色谱条件下，注入液相色谱仪进行测定，记录色谱图，考察系统适应性。

1.2.4.2线性关系的考察。HPLC自动进样器吸取工作液1、2、5、10、20、40 μL注入HPLC，记录色谱图，以进样浓度X(μg/mL)为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程。

1.2.4.3精密度试验。取对照品工作液，按“1.2.3”色谱条件连续进样6次，测定对照品工作液中喹乙醇、乙酰甲喹峰面积的RSD值。

1.2.4.4稳定性试验。取供试品溶液，在室温下放置0、1、2、6、12、24 h后，按“1.2.3”色谱条件，注入液相色谱仪进行测定，进样量10 μL，测定峰面积积分值，计算RSD。

1.2.4.5重复性试验。取同一批号的样品按“1.2.2”方法制备供试品溶液6份，按“1.2.3”色谱条件测定，进样量为10 μL，测定峰面积，计算平均含量和RSD。

1.2.4.6加样回收率试验。分别精密称取20、40、100 mg喹乙醇、乙酰甲喹原料添加在饲用植物提取物中，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，再按“1.2.3”色谱条件测定，进样量为10 μL，测定峰面积，计算平均回收率和RSD。

1.2.4.7检测限与定量限。采用空白饲用植物提取物，乙酰甲喹、喹乙醇添加量逐渐降低，样品经前处理和液相色谱分析后得到的添加回收率，实际测定得到的回收率和精密度能满足方法回收率(70%～120%)和精密度(RSD≤10%)要求的最低浓度作为方法检测限。

1.2.5空白样品的测定。取不含喹乙醇、乙酰甲喹的饲用植物提取物，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，再按“1.2.3”色谱条件测定。

1.2.6样品结果判定。取饲用植物提取物，每批按“1.2.2”方法制备样品，按“1.2.3”色谱条件注入液相色谱仪，通过乙酰甲喹、喹乙醇保留时间和光谱匹配度进行定性，测定峰面积，通过标准曲线计算样品含量。

2 结果与分析

2.1方法学考察

2.1.1系统适用性试验。图1～2表明，在“1.2.3”色谱条件下，乙酰甲喹、喹乙醇的保留时间分别为4.5、15.3 min左右，对照品溶液色谱主峰保留时间与供试品保留时间一致，分离度大于1.5，理论塔板数大于6 000。

图1 对照品喹乙醇(a)和乙酰甲喹(b)紫外光谱图Fig.1 UV spectrum of reference substance olaquindox(a)and mequindox(b)

图2 对照品色谱图Fig.2 Chromatogram of the reference substance

2.1.2线性关系的考察。按“1.2.4.2”方法操作，通过“1.2.3”色谱条件定量测定对照品，得喹乙醇、乙酰甲喹的回归方程分别为Y=5.37X-9.21(r=0.999 6)、Y=5.34X-4.21 μg/mL(r=0.999 8)，表明喹乙醇、乙酰甲喹浓度分别在5.03～201.32、5.04～201.38 μg/mL与峰面积呈现良好的线性关系。

2.1.3精密度试验。按“1.2.4.3”方法操作，计算喹乙醇、乙酰甲喹的峰面积RSD分别为0.46%、0.53%(n=6)，保留时间的RSD均小于1%，表明分析方法符合精密度的要求。

2.1.4稳定性试验。按“1.2.4.4”方法操作，计算试样中喹乙醇、乙酰甲喹的峰面积RSD为0.44%、0.86%(n=6)，表明供试品溶液在室温下放置24 h稳定。

2.1.5重复性试验。按“1.2.4.5”方法操作，测定样品中喹乙醇、乙酰甲喹的峰面积RSD分别为0.31%、0.42%(n=6)，保留时间的RSD均小于1%，表明此方法重复性良好。

2.1.6加样回收率试验。按“1.2.4.6”方法操作，测定样品中喹乙醇、乙酰甲喹的含量，结果见表1。从表1可以看出，喹乙醇、乙酰甲喹的平均回收率分别为99.76%、99.28%，RSD分别为0.97%、0.78%，表明回收率较好，该方法符合要求。

2.1.7检测限与定量限。按“1.2.4.7”方法操作，试验结果表明5 mg/kg是能达到方法回收率和精密度要求的最低浓度。根据10个空白样品的3倍平均信噪比对应的乙酰甲喹、喹乙醇含量进行添加回收试验，表明样品中5 mg/kg添加浓度的回收率虽能达到回收率要求，但精密度高于方法精密度要求，所以该方法检测限为5 mg/kg，定量限为10 mg/kg。

表1 回收率试验结果(n=6)

2.2空白样品的测定按“1.2.5”方法操作，结果见图3，试验表明供试品基质对待测物喹乙醇、乙酰甲喹没有干扰。

图3 空白样品色谱图Fig.3 Chromatogram of blank sample

2.3样品结果判定按“1.2.6”方法操作，空白样品色谱图未检出喹乙醇、乙酰甲喹，阳性样品的色谱图见图4～5，其喹乙醇、乙酰甲喹出峰的保留时间与对照品一致，初步判定样品添加了喹乙醇、乙酰甲喹；对阳性样品光谱图与对照溶液光谱图进行比较，图形非常一致，样品保留时间分别为4.5、15.2 min，色谱峰纯度角0.045°，纯度阈值0.248°，纯度角小于纯度阈值，说明光谱均匀，未包裹共流出物，满足检测要求，最终确证样品中非法添加了喹乙醇、乙酰甲喹。

3 讨论

3.1样品的处理方法该试验比较了超声波与振荡提取方法，发现超声波提取后的试样溶液因饲用植物提取物成分复杂，提取液杂质较多，目标物不易分离。有文献报道[6]，采用HBL小柱对试液净化，考虑到喹乙醇、乙酰甲喹在饲用植物提取物添加量大于50 mg/kg才能起作用，用HBL小柱净化后，回收率变化不大，因此采用振荡提取，提取液离心后直接上机检测，方法能够减少杂质干扰，降低成本，回收率稳定。

图4 供试品喹乙醇(a)和乙酰甲喹(b)紫外光谱图Fig.4 UV spectrum of sample olaquindox(a)and mequindox(b)

图5 供试品色谱图Fig.5 Chromatogram of the sample

3.2流动相的选择有文献报道[7]，用甲醇、乙腈、磷酸溶液作为流动相，经试验发现喹乙醇、乙酰甲喹分离度达不到要求，杂质有干扰，将溶液pH调到6.0，乙酰甲喹保留时间明显增加，提高分离度同时使峰型得到改善，减少拖尾和杂质干扰。

3.3波长的选择有文献报道[8]，采用380 nm测定喹乙醇、乙酰甲喹含量，经二极管阵列紫外检测器(DAD)全波长扫描，发现喹乙醇、乙酰甲喹在260 nm有最大吸收，380 nm为次吸收，而380 nm靠近可以光，试样中的色素有干扰，灵敏度不够，故采用260 nm作为测定波长，可以减少色素干扰，提高灵敏度。