图像辅助流式细胞仪在中华绒螯蟹血细胞分析中的应用

胡锦丽,刘逸尘,任星潮,耿绪云,孙金生,张亦陈

(天津市动植物抗性重点实验室，天津师范大学生命科学学院，天津 300387)

中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)亦称河蟹，属于软甲纲、十足目、弓蟹科，是我国重要的经济蟹种。近年来，随着养殖规模的不断扩大以及养殖环境的改变，各类疾病暴发的情况也愈加严重，导致河蟹的生长及品质都受到严重的影响，并造成巨大经济损失。河蟹是无脊椎动物，尚不具备完善的获得性免疫能力，主要依靠其非特异性免疫系统抵抗病原，各类血细胞承担了重要的免疫学功能，通过吞噬、包囊、结节和黑化等方式在防御过程中发挥着重要的作用[1-2]。

国内外已经有许多学者对甲壳动物血细胞的分类开展了一系列研究，但由于各种人工检测方法的分析原理和判别依据等的不同导致分类结果也有差异。例如，多位学者对克氏原螯虾各类血细胞的比例研究结果就不尽相同[3-5]。流式细胞仪是分析各种单细胞及颗粒样品常用的自动化设备。医学血液学检查中用其进行快速定量分析，并将结果作为重要的诊断参考。利用该类仪器还可将甲壳动物血细胞分为多个类群[6-8]，但边界尚不够清晰，因此应用还不普遍。

近年来出现的多维全景分析仪是一种新型图像辅助流式设备，可将流式的快速、高通量与多通道实时图像采集功能相结合，并改进了测量模块，能够获得更多维度的信息以及更为精准的量化检测结果。张树花等[9]首次将其应用于水产动物血细胞分析，通过图像辅助可以更为清晰地将鲫鱼不同类群的血细胞区分开。笔者将图像辅助流式细胞仪引入甲壳动物血细胞分析，尝试建立一种能够清晰分群的自动化方法。

1 材料与方法

1.1试验材料试验用中华绒螯蟹均购自天津市王顶堤水产批发市场，体重(104±5) g，置于实验室养殖系统，水温为(20±1) ℃，每天投喂2次。暂养5 d后，选取体表无损伤，附肢完整、活力旺盛的个体用于试验。

1.2试验试剂抗凝剂，参考洪宇航等[10]配制抗凝剂(338 mmol/L氯化钠，115 mmol/L 葡萄糖,30 mmol/L 柠檬酸三钠，10 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠，pH=7.0)。多聚甲醛购自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他试剂均为国产，分析纯。

1.3试验方法

1.3.1细胞悬液的制备。按抗凝剂∶血淋巴体积比1∶1，从中华绒螯蟹附肢基部抽取血淋巴，经4%多聚甲醛固定后用PBS重悬，4 ℃保存备用。

1.3.2显微镜观察。将上述细胞悬液制备滴片，用Leica DM5000型显微镜观察，根据胞内颗粒的差异对细胞归类、统计和分析。

1.3.3图像辅助流式细胞仪检测。该研究所使用的Merck Millipore公司的FlowSight多维全景流式细胞仪是一种图像辅助流式细胞仪，较常规机型相比具有升级的检测模块，除了可以更精准地测量常规参数外，还能同步采集每个细胞在各通道的图像。前述细胞悬液经70 μm细胞筛过滤去除黏连细胞团即可上机检测，每个样本采集3万个样点，数据和图像利用随机软件IDEAS Application 进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1显微镜观察结果显微镜下可见中华绒螯蟹血细胞呈椭圆形或近圆形，体积较大的细胞多呈椭圆形且胞内含有可分辨的颗粒状结构。不同细胞内所含的颗粒结构在大小及含量方面呈现显著差异，据此可将其分为r1～r4共4个类群。其中r1类群属于无颗粒细胞，其体积最小，胞质中没有明显可见的颗粒结构，胞核轮廓清晰可见，核质比大；r2类群为小颗粒细胞，体积和形态与r1类群接近，其显著特点是胞内具有少量散在分布的细碎小颗粒，这些颗粒形态不甚规整，含量变化幅度大；r3类群为中颗粒细胞，其体积较大，胞质内均匀分布较多近圆形、中等大小的颗粒，粒径约为r4类群胞内颗粒的3/5，细胞核多被颗粒遮挡；r4类群是大颗粒细胞，该类群细胞体积大，胞质内充满近圆形、大小较均匀的大型粒结构，粒径为细胞直径的1/9～1/8，胞核多被颗粒遮挡(图1)。各个类群细胞的测量数据如表1～2所示。

注:表示无颗粒细胞； 表示小颗粒细胞；表示中颗粒细胞；表示大颗粒细胞Note:Non-granular hemocyte；Small-granular hemocyte；Intermediate-granular hemocyte；Large-granular hemocyte图1 显微镜观察分类中华绒螯蟹血细胞Fig.1 Classicfication of Eriocheir sinensis hemocytes by microscopic observation

细胞类群Cell group细胞大小Cell size∥μm×μm颗粒大小Particle size∥μm×μm颗粒含量Particle content无颗粒细胞Non-granular hemocyte(11.73±0.95)×(9.47±0.50)——小颗粒细胞Small-granular hemocyte(12.75±1.12)×(10.64±0.97)(1.05±0.09)×(1.01±0.02)﹢中颗粒细胞Intermediate-granular hemocyte(14.58±0.72)×(12.48±1.29)(1.27±0.14)×(1.08±0.12)﹢﹢﹢大颗粒细胞Large-granular hemocyte(19.59±2.56)×(13.68±1.19)(2.18±0.31)×(1.85±0.23)﹢﹢﹢﹢

注：细胞大小和颗粒大小为长径×短径。“—”表示胞内没有可见颗粒；“+”表示胞内颗粒的丰度，“+”多表示胞内颗粒含量多

Note:The cell size and particle size are long diameter x short diameter.“—” means that there are no visible particles in the cell; “+” indicates the abundance of granule,more “+” mean more granules in the cell

2.2图像辅助流式细胞仪分析与显微镜依据可见的颗粒结构分类不同，流式细胞仪通过测量单细胞样点的散射特征可以更全面、准确地反映出中华绒螯蟹血细胞内的全部颗粒结构在分布范围(Area)和复杂程度(Intensity)方面的差异，并据此分类。散点图中单细胞样点呈现分群聚集的状况，各群之间具有明显的低密度样点过渡区，据此可将中华绒螯蟹血细胞清晰地划分为R1～R4共计4个类群。R1类群细胞的特征是没有明显的散射信号，即胞内无复杂的颗粒结构，同步的明场图像也提示细胞近透明状。R2类群散点分布区间呈现面积略大、强度较低的特点，表明胞内颗粒分布较广，但颗粒本身的结构相对较简单，明场通道的图像显示胞内具有少量折光组分。R3类群细胞样点分布区间向散点图中的高复杂度方向偏移，但色散面积没有显著增大，即呈现一种颗粒结构复杂度提高的趋势，明场通道显示胞内具有更多高反差区域，表明具有结构更复杂的成分。R4类群细胞样点集中在图的右上部，即颗粒结构的分布范围和颗粒复杂程度都超过前面3个类群，同步采集的图片显示该类群细胞内具有大面积的高反差影像，提示其中充满结构复杂的成分(图2)。色散测量反映的是胞内全部颗粒的整体状况，R1～R4类群可以据此分为无、小、中及大颗粒细胞4个类群，其占血细胞总量的比例范围分别是(54.33±3.38)%、(27.63±2.10)%、(5.43±0.35)%、(12.51±3.38)%(表2)。

进一步分析每个类群细胞的大小分布区间，结果显示，从R1到R4类群细胞大小分布区间逐渐右移，即R1

3 结论与讨论

该研究采用2种方法分别依据明场观察和色散测量对中华绒螯蟹血细胞内的颗粒结构从不同角度进行差异比较，并据此划分不同的细胞类群，因此分类结果既有相似之处又存在一定差异。针对颗粒特征的2种分析方法都能将中华绒螯蟹血细胞划分为4个类群，并观察到细胞大小具有随着胞内颗粒增加而增大的趋势，而且前两类细胞的总量远远大于后两类细胞之和等一致的特点。不同之处在于2种方法分别划分的各类群细胞的比例存在差异，其原因主要是测量的依据不完全一致。显微镜观察分类依据的是镜下可见的颗粒结构差异，而图像辅助流式细胞仪测量的色散值反映的是胞内各种大小颗粒及复杂结构总量的差异。相比显微镜观察，基于高分辨率测量模块分析的流式方法具有便于量化、准确性高、重复性好且高通量等优点，更适合于自动化分析。

注：BF.明场图像；SSC.色散图像；R1.无颗粒细胞；R2.小颗粒细胞；R3.中颗粒细胞；R4.大颗粒细胞Note:BF.Bright field image; SSC.Side scatter image; R1.Non-granular hemocyte;R2.Small-granular hemocyte; R3.Intermediate-granular hemocyte; R4.Large-granular hemocyte图2 中华绒螯蟹血细胞流式分析散点图Fig.2 Scatter plot of blood cell flow analysis of Eriocheir sinensis

图3 中华绒螯蟹4种血细胞大小分布Fig.3 Distribution of blood cell size in four species of Eriocheir sinensis

血细胞具有重要的免疫功能，很多学者在这方面开展了深入的研究，采用显微、亚显微观察、染色特征分析、流式测量等将多种甲壳动物的血细胞划分为3～4个类群甚至更多的亚类(表2)。Gupta[14]依据染色观察将束腹蟹(Paratelphusamasoniana)血细胞分为透明细胞、半颗粒细胞及颗粒细胞3类。Zhou等[15]参考显微及亚显微结果，并结合常规流式细胞分析认为拟穴青蟹血细胞也是由前述3种类型构成，但各类型细胞的比例与其他物种差异较大。陆宏达[11]将中华绒螯蟹的血细胞进行瑞氏-吉姆萨染色后分为4类，即无颗粒细胞、小颗粒细胞、中颗粒细胞以及大颗粒细胞。洪宇航等[10]和周凯等[12]根据显微观察及染色特征等分别将中华绒螯蟹和锯缘青蟹的血细胞分为无颗粒细胞、小颗粒细胞、中颗粒细胞和大颗粒细胞4类，比例范围与该研究观察较为接近。Lv等[13]根据显微观察结果把中华绒螯蟹血细胞分为透明细胞、半颗粒细胞及颗粒细胞3个大类，但各种细胞所占比例与同类研究不同，原因是其先把含有少量颗粒的细胞也划入透明细胞类群，然后又参考瑞氏-吉姆萨染色结果将透明细胞类群进一步分为3种亚型。该研究在显微镜观察中未使用辅助染色，而是仔细将含有少量颗粒的细胞与无颗粒细胞区分开，从而把中华绒螯蟹血细胞划分成4个类群，无颗粒及小颗粒细胞之和同Lv等[13]划分的透明细胞类群均占各自血细胞总量的60%左右，中颗粒和大颗粒细胞也与其划分的半颗粒及颗粒细胞比例范围接近，均占比20%左右。目前对于甲壳动物血细胞内可辨识颗粒特征的鉴别尚无统一的量化标准，因此不同的研究结果之间存在一定的差异；另一方面，观察辨识的工作量十分巨大，这些原因都限制了人工“验血”的规模应用。

表2 该研究结果与已发表结果的对比

流式细胞仪是一种先进的自动化设备，常用来进行细胞的分类分析，Zhou等[15]和Thayappan等[16]根据常规流式细胞仪的测量结果将拟穴青蟹和鼠蝉蟹(Emeritaemeritus)的血细胞划分为透明细胞、半颗粒细胞及颗粒细胞3个类群，冼建安等[17-19]利用流式细胞仪从克氏原螯虾、罗氏沼虾和杂色鲍血细胞中分辨出透明细胞、小颗粒细胞及大颗粒细胞3个类群。基于常规流式细胞仪检测，通常可将甲壳动物血细胞分为3个类群，但各个类群之间的界限不甚清晰，加之边界细胞的形态及内部特征等状况需要收集检测后方可确定，进一步加大了精确分群的难度，因此采用常规流式细胞仪开展甲壳动物血细胞自动化分析的应用尚不多见。该研究所采用的图像辅助的新型流式细胞仪，亦被称为多维全景分析仪，升级了测量模块，增加了测量参数，因此可以较以往的流式分析获得更为精确的测量数据和更加全面的测量维度。该研究结果也证实了这一点，不但清晰地分辨出了4个细胞类群，并进一步通过图像佐证确保分群结果的准确性，而且还避免了收集边界细胞再检测等繁琐的操作。与高等动物的血细胞类似，甲壳动物的血细胞遍布全身，是免疫系统的重要组分，因此一直都是关注的焦点。很多研究采用各种方法对其分类和功能开展了大量分析，但由于分类依据尚未统一以及量化标准还没建立，因此各种分类结果及功能分析之间既有联系又存在一定的差异。该研究利用新型的检测仪器建立了一种区分度高且便于量化操作的自动化方法，并从中华绒螯蟹血淋巴中清晰地鉴别出4个类群的细胞，同步采集的图像进一步验证了分群结果的准确性，另一方面，每分钟数万样本的高通量既提高了结果的可靠性，同时又极大地减少了人工操作强度。

哺乳动物血细胞最初仅能分辨红细胞与白细胞2个类群，现阶段利用各种新型的检测技术以及白细胞的分化抗原等进行更加细致的甄别，便不断有新的细胞类型及功能特征被发现。对甲壳动物血细胞来说，基于不同方法鉴别的细胞类群的特征和比例既有联系又有差异，表明还有很多特征及功能尚未被发现。晋伟等[20]提出应将图像辅助流式细胞仪等新型检测手段应用于水生动物血细胞分析，并加快检测专用抗体的开发，以从基础上促进自动化“验血”技术在水生动物中的广泛应用。参考哺乳动物血细胞的研究历程有理由推断，随着研究技术的进展、检测水平的提高和分析维度的增加，特别是针对甲壳动物血细胞表面分子的各种商业化抗体的筛选以及抗体组研究的进步，必将有更多的细胞类型和更精细的功能差异被逐步发现，从而促进对甲壳动物血细胞功能的全面系统解析。