适于草果遗传多样性分析的RAPD引物筛选*

谢正万,宁德鲁,周军,吴涛,肖良俊,陈海云

(1.西南林业大学林学院,云南 昆明650224;2.云南省林业科学院,云南 昆明650201)

草果 (Amomum tsao-ko)是姜科 (Zingiberaceae)豆蔻属 (Amomum Roxb.)植物,主产于广西、云南、贵州等地,具有燥湿除寒、除痰、消食化食的功效,主治疟疾、小腹冷痛、泻痢、吐逆等[1]。全球约有150多种豆蔻属植物,中国有24种,分布在热带区域。云南是国内草果的主产地,主要产于云南西南部的保山腾冲和普洱市的澜沧,东南部的红河州金平县、屏边县、绿春县和元阳县,以及文山州的马关县、麻栗坡县和西畴县,西部的德宏州陇川、盈江两县,西北部的玉溪新平县,怒江州泸水县、福贡县和贡山县等地[2]。草果既是一种调味品,又可作药材使用,尽管近年来需求量越来越大,但其产量较低。目前,草果的研究主要集中于化学成分和药理等方面。如Yang等[3]利用水蒸气蒸馏法从草果中提取出挥发油,并从中鉴定出了73种成分;吴燕飞等[4]利用超临界CO2流体 (SFE-CO2)萃取的方法得到了草果油,并用气相色谱-质谱联用仪 (GC/MS)鉴定出了32种成分;草果挥发油对黄曲霉等6种霉菌有很明显抑菌作用[5]。虽然我国草果的栽培历史已经有200多年,但因为未进行专门的种质资源的分类整理,草果的栽培品种混乱,从而导致草果产量不高[6]。因此,研究草果的遗传多样,掌握草果种质资源的遗传背景和亲缘关系,为草果的种质资源开发与利用提供信息,这是非常有必要的。但是近年来,对草果分子方面的研究甚少,仅见严美荣[7]利用SSR技术对草果的遗传多样性进行了研究。

RAPD(Random amplified polymorphism DNA)(随机扩增多态性DNA)技术于1990年创建,该技术以其流程简单、安全快速、花费不高、多态性丰富、适应性广、无需同位素等优点,在遗传多样性分析、外源DNA的快速鉴定等方面得到了普遍应用[8-10]。利用RAPD分子标记技术时,所用的引物是随机引物,因此首先需要对引物进行筛选[11]。本实验以12份草果为材料,利用RAPD标记技术对192个RAPD随机引物进行了筛选,为今后利用RAPD技术对草果进行遗传多样性分析等研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为云南省文山州西畴县和德宏州陇川县的12株优良无性系,株龄6-8年 (表1)。采集草果新鲜无病虫害的嫩叶,保存在盛有硅胶的自封袋里使其脱水干燥,用于提取DNA。

表1 12份供试材料来源Tab.1 The origins of 12 tested materials

1.2 研究方法

1.2.1 基因组DNA提取

利用植物DNA提取试剂盒 (康为世纪生物科技有限公司,北京)提取草果基因组DNA,然后用0.8%的琼脂糖凝胶对DNA进行电泳检测其质量,放在-20℃下保存,备用。

1.2.2 引物筛选及PCR扩增

供试的192个RAPD引物由北京赛百盛基因技术有限公司提供,每套有20个引物,分别为A1-A20、B1-B20、 C1-C20、 D1-D20、 E1-E20、 F1-F20、 G1-G20、H1-H20、M1-M20、N1-N12。从 12份草果样品的DNA溶液中分别取30μL,混合后作为混合模板用来进行引物筛选。筛选出条带清晰、有差异的条带和重复性好的引物。25μL的RAPD-PCR反应体系中包括2×Taq MasterMix(康为世纪生物科技有限公司,北京)12.5μL,DNA 模板 1μL(50ng),10mM/L引物1.0μL,ddH2O补足。PCR仪型号为TProfessional Standard Gradient 96(Biometra,德国)。扩增程序为94℃预变性2min;94℃变性30s,40℃退火40s,72℃延伸30s,共40个循环;72℃延伸5min;4℃保存。最后所得到的PCR扩增产物需要用2%的琼脂糖凝胶来进行电泳分离,然后用溴化乙锭 (EB)染色20min,最后用凝胶成像仪(百晶)拍摄图像。

1.2.3 PCR扩增条带的统计和分析

根据所得电泳图谱,统计清晰的DNA条带,以及可重复性弱带,记为1,而在相同位置上没有条带的记为0,最终得到0和1的原始矩阵。为了分析所测样品的遗传相似性,利用NTSYS-pc软件计算其遗传相似系数 (genetic similarity,GS),然后通过UPGMA方法进行聚类分析,并用Tree plot程序生成系统树图。根据记录结果,分别统计每条引物扩增出来的DNA总带数,以及其中包含的多态性带数,然后计算多态性带百分率 (percentage of polymorphic bands,PPB),PPB=多态性带数/扩增带总数×100%。

2 结果与分析

2.1 RAPD引物筛选结果

实验选用192个RAPD随机引物,分别对12个草果样品的混合DNA模板进行PCR扩增,最后筛选出21个RAPD引物 (表2)。图1展示了G1-G20和H1-H4共24个引物筛选的结果。

表2 筛选出的RAPD引物及序列信息Tab.2 Primers screened in this study and their sequences

图1 部分引物筛选时的RAPD-PCR扩增产物电泳结果Fig.1 Results of PCR amplification using parts of RAPD primers

为验证所得引物是否有效,分别用21个引物对本次实验所选12份草果样品进行RAPD-PCR扩增。结果表明,这些引物的扩增图谱条带清晰、重复性好且在12份样品中具有多态性,说明所得引物是有效、可靠的。图2为12份草果样品的在引物A17和B01下的RAPD-PCR扩增图谱。

图2 引物A17(左)和B01(右)的RAPD-PCR扩增结果Fig.2 Results of PCR amplification using RAPD primers with SBSA17(Left)and SBSB01(Right)

2.2 RAPD标记数据统计及扩增结果

21个RAPD引物扩增条带结果统计见表3。由表3可知,21个引物共得到177条带,其中多态性带有119条,占扩增总带数的67.2%,每个引物平均得到8.4条带和5.7条多态性带。统计发现,用这21个引物扩增得到的DNA总条带数与多态性带数之间差异比较大,扩增出条带数最多的引物是SBSH01和SBSM18,都有12条,而扩增出条带数最少的引物是SBSA15,扩增出的条带仅有4条;多态率最高的引物为SBSF17,达到90%,最低的为SBSB10,仅有14.3%。

表3 21个引物的扩增结果Tab.3 The RAPD amplified result with 21 primers

2.3 12份样品的遗传相似系数及聚类结果

利用NTSYS-pc软件来计算草果间遗传系数(GS),最终得到12份草果材料之间的遗传相似系数表 (表4)。由表4可以看出,12份草果样品间的GS值变化范围为0.559 3-0.898 3,平均GS值为0.733 1。在所有样品中,06号样品和11号样品之间的GS值最小,为0.559 3,说明这两种样品之间的遗传差异最大;而11号样品和12号样品之间的GS值最大,为0.898 3,两样品之间的遗传差异最小。12个样品中,01和02,02和03,03和07,05和06、07,06和08,07和08,09和10、12,10和11、12,11和12遗传相似系数都较大,均大于或等于0.800 0。

表4 12份供试草果样品的遗传相似系数Tab.4 Genetic similarity of twelve tested materials of Amomum tsao-ko

据前面所得的草果遗传相似系数矩阵,利用UPGMA法构建了12份草果样品之间的遗传关系系统树 (图3)。从系统树状图中可得12份样品聚为A组和B组,其中A组又可分两个亚组。A组包括西畴县小桥沟的全部8个样品,其中01-04这4份优良无性系为一个亚组,09-12这4份优良单株为另一个亚组,并且11和12这两份优良单株的遗传关系最近;B组包括陇川县4个乡镇的全部4个样品 (05-08)。

图3 12份草果样品遗传关系树状图Fig.3 Dendrogram of 12 populations of Amomum tsao-ko constructed using UPGMA cluster analysis(NTSYS)

3 结论与讨论

本次实验用12份草果样品作为供试材料,最终从192个RAPD随机引物中成功筛选出21个有效引物。PCR扩增实验中21个引物共得到177条DNA条带,其中多态性带占了67.2%。这为以后用RAPD标记技术对草果的遗传多样性进行研究奠定了良好的基础。

本研究利用这21个引物的扩增结果按UPGMA法进行聚类分析,最后得到的聚类分析结果将这12份草果样品分为A组和B组。所得结果很好地对应了西畴县和陇川县的8份和4份草果样品,能够较好地将草果材料根据地理来源进行区分。说明所筛选得到的21个RAPD引物适宜用来分析研究草果的遗传多样性。

该研究中草果的PPB为67.2%,远高于豆蔻属的砂仁 (Amomum villosum,PPB=40.74%)[12],姜科的温郁金 (Curcuma wenyujin,PPB=31.7%[13],与姜科的姜黄 (Curcuma longa,PPB=67%)[14]和姜 (Zingiber officinale,PPB=64.91%)[15]相近。研究结果初步表明,草果的遗传多样性较为丰富,为下一步优良单株选育和新品种杂交育种的亲本选择提供了基本的理论依据。

草果的近缘植物有野草果A.koenigii、拟草果A.paratsaoko等。红草果 (A.hongtaoko)为草果的异名。在我国,共有3种豆蔻属植物被当作草果使用,即分布于云南的草果;产于广西、云南的拟草果及产于广西、云南的野草果[16]。近几年来拟草果、野草果以及草豆蔻 (A.katsumadai)因为在外观和性状方面与草果很相似[17],因此掺假现象也就比较严重,而通过查阅资料,发现近年来对草果及其混淆品的鉴定从其性状特征上研究的比较多,如罗晓霞[18]、余南才等[19]、高学昌[20]从草果的性状特征方面对草果和其混淆品拟草果、草豆蔻、砂仁进行了比较鉴别,而分子方面的仅有严美荣[7]利用ITS序列差异方法对草果和拟草果进行了鉴定。RAPD分子标记技术已经普遍应用于物种亲缘关系鉴定方面,为果树品种鉴定等工作开辟了一条新路,本文采用RAPD技术筛选出了适合用在草果遗传多样性分析上的有效引物,这为草果以后的分子鉴定等研究奠定了一定基础。本研究仅做了草果分子鉴定方面的引物筛选,如需对云南省内分布的草果资源进行全面的了解,还要对草果的资源分布进行全面细仔地调查,并进行分子水平上的遗传多样性的聚类分析,利用聚类结果分析出不同种源地之间亲缘关系的远近,选择亲缘关系较远的育种材料为亲本,以选育出更为优势、更符合云南当地发展的草果优良品种。