索拉菲尼联合TRAIL对诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的影响

王德华,刘云燕,李敏然,苗同国,孙杏丽,任桂芳

原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，易发生侵袭转移，预后差。近年来，随着手术、介入治疗、射频消融治疗等多手段的综合应用，肝癌的治疗得到进展；但由于该病起病隐匿，发展迅速，部分患者发现时已经失去了综合治疗的机会；因此，分子靶向药物成为晚期肝癌的主要治疗方法之一。索拉菲尼(SOR) 是一种多激酶抑制剂，一方面通过作用于Raf激酶直接抑制肿瘤细胞增殖，一方面通过作用于血管内皮生长因子受体、血小板源生长因子受体-β等抑制肿瘤新生血管生成，一定程度上抑制肝癌细胞生长[1-2]。肝癌的病程进展由多种细胞因子参与，而肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)就是其中之一。TRAIL属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族，能诱导多种肿瘤细胞凋亡，但对机体正常细胞无毒性，故TRAIL被认为是TNF超家族最有潜能的抗肿瘤细胞因子。由于内源性或获得性的TRAIL抵抗，使一些癌细胞对TRAIL诱导的凋亡发生了耐受。文献报道，TRAIL联合顺铂、阿霉素等化疗药物可增加肝癌细胞对TRAIL的敏感性[3-5]。但目前关于SOR联合TRAIL作用于肝癌细胞的相关研究较少，故本文将观察两者联合诱导肝癌细胞凋亡的情况。

1 材料与方法

1.1细胞株 肝癌细胞株SMMC-7721，购于中国科学院上海细胞生物学研究院，表型为低分化人肝癌细胞。

1.2主要试剂 SOR[N-(3-三氟甲基-4-氯苯基)-N-(4-(2-甲基氨基甲酰嘧啶)苯氧基)尿素](美国拜耳公司)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司)；TUNEL凋亡试剂盒(北京中山生物技术公司)；兔抗人Mcl-1多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；HRP标记山羊抗兔IgG(北京中山生物技术公司)；兔抗β-Actin多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；硝酸纤维素膜(华美生物工程公司)。

1.3细胞培养 将肝癌细胞株SMMC-7721细胞放于含10%的新生小牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、4 mmol/L谷氨酰胺及1 mmol/ml的HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸)混合成的RPMI-1640培养液中，置于37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中培养。当细胞呈单层致密状时，用0.04%的ETDA消化后以1∶3传代，24 h换液，每3 d传1次代，取对数生长期细胞用于实验。

1.4比色法检测细胞生长抑制率 取对数生长期细胞用0.25%胰蛋白酶消化后制备细胞悬液，以1×104个/孔，接种细胞到96孔细胞培养板。培养24 h细胞贴壁后分为3组，SOR组予不同浓度的SOR(0、1、2、4、8 μmol/L)进行干预，TRAIL组予不同浓度的TRAIL(0、10、100、500、1000 ng/ml)进行干预，联合组予SOR和TRAIL联合干预(剂量同前)。每组浓度均设4个重复孔。继续培养24 h，每孔加入5 mg/ml的MTT，37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱中孵育4 h，小心吸弃上清液，每孔加入150 μl的DMSO，震荡10 min后在酶联免疫检测仪上选择570 nm波长测定各孔的吸光度值(A)。以未加药的细胞株为对照组，计算各组细胞生长抑制率。生长抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。

1.5流式细胞仪测定细胞凋亡率 将对照组(无血清培养基)、SOR干预组(2 μmol/L)、TRAIL干预组(100 ng/ml)及SOR联合TRAIL组(2 μmol/L+100 ng/ml)分别作用肝癌细胞株SMMC-7721细胞24 h后，收集细胞，PBS清洗2次，离心，70%乙醇4℃固定，溴化己啶染色30 min，用流式细胞仪作凋亡分析。

1.6Western Blotting 分析 SDS-PAGE灌胶后加入电泳工作液中，上样后电泳。电泳结束后转膜。取出硝酸纤维素膜，在封闭液中4℃封闭过夜。封闭结束后，TPBS摇晃洗膜3次，以封闭液稀释兔抗人Mcl-1多克隆抗体、兔抗β-Actin多克隆抗体，封膜机封口，4℃过夜。再次取出硝酸纤维素膜，TPBS振摇洗膜3次，以封闭液稀释辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG。按每平方厘米膜加入0.1 ml第二抗体溶液，封口，室温摇动孵育2 h。最后进行发光反应，X线胶片进一步显影、定影即可见成像条带。采用美国Kodak公司ID数码成像分析系统软件对Western blot结果进行定量分析，灰度值以积分光密度值(IOD)表示。

2 结果

2.1SOR和TRAIL对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响 MTT法结果显示，不同浓度SOR单独处理肝癌SMMC-7721细胞24 h后，细胞生长抑制率随着浓度的增加而逐渐增强，细胞抑制率均高于对照组(P<0.05)。不同浓度TRAIL单独处理肝癌细胞SMMC-7721 24 h后，其细胞生长抑制率呈现剂量依赖性，各组之间细胞生长抑制率差异有显著统计学意义(P<0.05)。当SOR浓度为1 μmol/L时，细胞抑制率<10%，选择1 μmol/L的SOR联合不同浓度TRAIL处理肝癌SMMC-7721细胞24 h后，其抑制率均高于相同浓度TRAIL单药处理组(P<0.05)。见表1。

注：SOR为索拉菲尼，TRAIL为肿瘤坏死因子相关凋亡配体

2.2SOR和TRAIL对肝癌细胞SMMC-7721凋亡的影响 对照组、SOR干预组(2 μmol/L)、TRAIL干预组(100 ng/ml)及SOR联合TRAIL组(2 μmol/L+100 ng/ml)处理SMMC-7721细胞24 h，SMMC-7721细胞的凋亡率分别为(2.01±0.58)%、(22.58±5.03)%、(19.87±2.05)%与(45.86±3.01)%。3组药物干预组细胞凋亡率均显著高于对照组(P<0.1)，SOR干预组的细胞凋亡率与TRAIL干预组比较差异无统计学意义(P>0.05)。而联合组的细胞凋亡率显著高于其他2组(P<0.05)。

2.3SOR和TRAIL对肝癌细胞SMMC-7721内Mcl-l蛋白表达的影响 Western blotting测定结果显示，在40kD的位置出现一条杂交带，43 kD处出现内参照β-actin的特异条带。TRAIL干预组(100 ng/ml)、SOR干预组(2 μmol/L)及SOR联合TRAIL组(2 μmol/L+100 ng/ml)处理细胞12 h后，联合组Mcl-1表达水平显著低于对照组。见图1。

3 讨论

近年来，诱导肿瘤细胞凋亡是抗癌治疗的热门研究课题。TRAIL是1995年Wiley等[6]发现的TNF超家族中一个诱导凋亡的分子，它属于Ⅱ型跨膜蛋白，广泛表达于多种正常细胞，通过与不同的受体结合而发挥不同的生物学作用。Fabregat等[7]检测人肝癌组织中TRAIL及其受体的表达，发现TRAIL在癌旁组织中的表达量最高，癌组织中次之，正常肝组织中无表达，其受体DR4、DR5的表达量在肝癌组织中显著高于正常肝组织。这表明TRAIL是通过其受体DR4和DR5发挥抗肝癌作用。DR4和DR5具有与TNF受体超家族其他成员类似的胞质死亡区，可与TRAIL特异性结合后，通过胞质中的死亡结构域激发和传导凋亡信号，激活caspasesa参与的酶联反应诱导细胞凋亡。DcR1无胞内区，DcR2胞内区不完整，因此，虽然DcR1和DcR2可以与DR4、DR5竞争性结合TRAIL，不能传导凋亡信号，反而抑制细胞凋亡[8]。

图1索拉菲尼对SMMC-7721细胞内Mcl-l蛋白表达的影响

A为对照组，B为TRAIL干预组、C为索拉菲尼干预组、D为索拉菲尼联合TRAIL组

TRAIL可诱导多种癌细胞凋亡，同时对正常组织没有明显的毒副反应[9]。本研究显示，不同浓度TRAIL处理肝癌SMMC-7721细胞后，其细胞生长抑制率随浓度的升高而增加，且一定浓度的TRAIL也可诱导细胞凋亡。目前有部分癌症对TRAIL产生耐药性，其耐药机制包括细胞膜表面TRAIL受体的改变、某些miRNA的表达、Caspase氧化还原等原因[10-12]。因此，需寻找能特异性增强TRAIL诱导细胞凋亡作用的药物。

SOR是目前世界上第一个被批准应用于临床的分子靶抗癌向药物，多项临床试验已证实SOR可延长肝癌患者的生存期及改善其预后[13-15]；其作用机制之一在于靶向作用于肿瘤细胞及肿瘤血管上的Ras/Raf/MEK/ERK信号转导通路，直接抑制肿瘤细胞生长；并且SOR可以阻断肿瘤新生血管形成，同时起到抗肿瘤细胞和血管生长的双重作用。文献报道，SOR能抑制HepG2细胞株的Raf激酶活性，从而阻断MEK/ERK信号转导途径，可降低细胞内cyclinD1水平，抑制癌细胞增殖[16]。本研究结果发现，不同浓度SOR处理肝癌SMMC-7721细胞后，细胞生长抑制率会随着浓度的增加而逐渐增强，选择一定浓度SOR联合TRAIL处理细胞后，其抑制率均高于TRAIL单药处理组。

SOR能抑制Raf/MEK/ERK信号传导通路，降低elF4E磷酸化水平下调Mcl-1表达，从而诱导肝癌细胞株凋亡。Mcl-1是Bcl-2凋亡控制蛋白家族中的抗凋亡成员之一，可通过与Bcl-2蛋白家族中促凋亡成员如Bim、Bak等结合，组织线粒体释放细胞色素C。另外，Mcl-l也可通过与截短的Bid结合阻断内源性和外源性凋亡信号的交叉联系。因此，诸多研究提示Mcl-l的表达在内源性和外源性凋亡信号通路中均起到重要作用[17]miR-26b可以负调控Mcl-1的表达，可增敏TRAIL诱导的肝癌细胞的凋亡，故miR-26b-Mcl-1可为肝癌治疗的新通路[18]。而SOR与Apo2L/TRAIL受体激动剂抗体结合可增敏Apo2L/TRAIL抵抗细胞，亦增加Apo2L/TRAIL敏感细胞的致敏性，而Jak2-Stat3-Mcl1通路是SOR介导致敏化Apo2L/TRAIL的关键[19]。本研究结果显示联合组Mcl-1表达水平最低。

SOR或TRAIL于体外呈剂量依赖式抑制肝癌细胞的增殖，适量浓度的SOR联合TRAIL可增强肝癌细胞的凋亡，其机制有可能通过Mcl-1这一结点发挥了协同作用。因此，本研究结果提示SOR联合TRAIL可能为肝癌的治疗提供新的治疗方法，其具体机制有待进一步研究。