乳酸菌抗氧化调控体系研究进展

杨明阳，田建军，景智波，赵丽华，张开屏，靳 烨,*

（1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古商贸职业学院食品工程系，内蒙古 呼和浩特 010070）

机体发生氧化反应时会产生自由基，正常情况下自由基的产生和清除处于动态平衡，而外界条件会破坏平衡导致机体出现氧化应激，机体内的生物大分子被破坏、组织器官的功能下降、老化速度加快，进而引发一系列疾病包括癌症、动脉粥样硬化、糖尿病和关节炎等[1]。因此，自由基与疾病的关系受到越来越多的关注，而寻找和开发天然无毒的抗氧化剂也成为各个领域的研究热点，预计到2018年，抗氧化剂的市场价值将以4.5%的年增长率增长至2.385亿 美元[2]。研究表明，乳酸菌具有提高机体免疫力、防止人体衰老、维持肠道菌群平衡、抗癌、降糖和降脂等生理功能，并且其在多种体内外实验中均已被证实有较好的抗氧化活性[3-4]。乳酸菌被认为是天然抗氧化剂的主要来源之一，其抗氧化作用成为各个领域学者研究的热点，乳酸菌抗氧化特性的深入研究对新型功能性食品生产和药品研发具有重大的意义。为了更加全面地了解乳酸菌，对乳酸菌作用机制的研究迫在眉睫。

1 乳酸菌抗氧化作用调控体系

乳酸菌是一类革兰氏阳性、过氧化氢酶（catalase，CAT）阴性、无芽孢细菌的总称[5]，巴斯德于1857年首次发现乳酸菌，俄国病理学家Metchnikoff于1908年在乳酸菌发酵酸奶中发现乳酸菌的抗氧化作用[6]。研究发现，乳酸菌具有明显的抗氧化作用，其抗氧化作用的本质是清除自由基、螯合金属离子、提高抗氧化酶活力等[7]。目前对于乳酸菌抗氧化作用特性的研究还没有明确结论，就当前而言，乳酸菌的抗氧化机制主要为如下几种（图1），而乳酸菌的各种调控机制不是单一作用而是相互关联的[8]。

图 1 乳酸菌抗氧化作用调控体系[8]Fig. 1 Regulation system of antioxidant activity of lactic acid bacteria[8]

1.1 氧化还原调控系统

乳酸菌氧化还原调控系统较多，其中最主要的是Trx系统、GSH系统和“NADH氧化酶/NADH过氧化酶”系统，电子转移程度对氧化还原系统的作用具有重要影响。

Trx系统由Trx、硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase，TrxR）和还原型辅酶II（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）组成，细胞质中的Trx系统如图2所示[9]。Trx是分子质量为12 kDa左右的多肽，调节氧化还原反应的位点是Cys-Gly-Pro-Cys[10]。Trx系统能维持干酪乳酸菌细胞内巯基/二硫键平衡，Trx通过调控细胞凋亡信号调节激酶1（apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1）促进MAPKs的表达或调控核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）通路等抑制细胞衰亡，参与氧化还原反应[11]。

GSH系统主要是由GSH、GPx、谷胱甘肽还原酶（glutathi-one reductase，GR）以及谷胱甘肽转硫酶（glutathi-one-S-transferase，GST）组成，能直接清除机体自由基，防止细胞损伤[12]。GSH是一种非蛋白肽（Glu-Cys-Gly），通过上调抗凋亡基因B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、下调促凋亡基因Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）表达，清除机体内自由基，调节凋亡基因Bcl-2与Bax的比值，发挥抗氧化作用，决定细胞的存在状态。GSH系统中最重要的抗氧化酶是GPx，研究表明，它的缺失会使体内H2O2含量上升，脂质过氧化物含量增多[13]。给自发性高血压小鼠灌胃干酪乳杆菌8 周后，发现小鼠丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量明显下降，GSH含量明显升高，说明干酪乳杆菌能够调控谷胱甘肽系统，改善高血压[14]。GSH系统和Trx系统多数情况下是平行工作的，然而越来越多的研究表明，Trx系统可能诱导GSH系统的抗氧化表达发挥抗氧化作用，当Trx的TrxR的电子传递途径受阻时，GSH系统可以作为一个备份系统，如图2所示。

图 2 细胞质中的Trx和GSH系统[9]Fig. 2 Trx and GSH systems in the cytosol[9]

GSH和Trx是哺乳动物体内两种主要的巯基依赖性的抗氧化系统。如图2所示，Trx系统通过TrxR催化NADPH氧化酶供氢，将氧化型Trx转化为还原型，向Prx提供电子。还原型Trx调节许多氧化敏感的转录因子如NF-κB、Nrf2与ASK1等参与氧化还原反应，当Trx从TrxR的电子传递途径受阻时，GR会以NADPH作为电子供体，将氧化型GSH还原为GSH，GSH能激活GPx活性达到清除脂质过氧化物和H2O2的目的。同时GSH能在体外将氧化型Trx还原，作为TrxR的备份，为Trx提供电子。

乳酸菌中的NADH氧化酶产生H2O2，促使NADH过氧化酶清除H2O2，防止细胞损伤。研究发现，嗜酸乳杆菌和双歧杆菌在0%、5%、10%、15%和21%的氧气中相互作用，通过NADH氧化酶/NADH过氧化酶系统抵抗氧胁迫[15]。

1.2 调控信号通路

研究表明乳酸菌能够调控与氧化应激相关的信号通路以缓解氧化损伤。目前，乳酸菌的主要调控通路是Nrf2/ARE，它能调节机体超过1%的基因，正常状态下，含蛋白E3泛素连接酶（cubiquitin protein ligase E3，CUL3-E3）的Nrf2与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1）偶联被锁定在细胞质中，当发生氧化应激时通过作用于特异性半胱氨酸残基Keap1引起Keap1-CUL3-E3泛素连接酶的构象变化，Nrf2与Keap1分离，并快速移动到细胞核中，与ARE结合，诱导抗氧化酶/蛋白如GST、奎宁氧化还原酶（nicotinamide quinone oxidoreductase 1，NQO1）、血红素加氧酶（heme oxygenase-1，HO-1）和SOD、Trx、p53等的表达，以此缓解氧化损伤[16]。Gao Dawei等[17]发现服用植物乳杆菌FC225能明显提高高血脂小鼠SOD和GPx活力，提高肝细胞核中Nrf2表达量，植物乳杆菌FC225能够通过调控Nrf2/ARE通路发挥抗氧化作用。Yang Xin等[18]利用植物乳杆菌JM113饲喂雏鸡，发现雏鸡肠黏膜内MDA含量显著降低，同时激活Nrf2信号通路，诱导其下游调控氧化应激的基因H0-1 mRNA的表达，说明分离自藏鸡肠道内的植物乳杆菌JM113能调控Nrf2/ARE通路，诱导其下游抗氧化基因的表达。抗氧化酶通过氧化还原反应将自由基转化为安全无毒的物质，或通过增强自身水溶性促进自由基排除。乳酸菌能够通过提高抗氧化酶活力防止机体受到损伤。这些酶类物质自由基代谢途径在不同部位发挥着协同作用，如CAT和GPx会将SOD清除超氧阴离子自由基形成的过氧化氢（H2O2）分解成水和氧气，从而防止羟自由基（·OH）的形成[19]。抗氧化酶活力的高低间接反映菌体清除自由基的能力，而MDA作为脂质过氧化的产物，其含量又间接反映自由基损伤机体的严重程度，因此抗氧化酶活力和MDA含量通常是同时测定的[20]。Wang Ying等[21]在新疆驼乳酸奶中经过体外实验筛选出1 株具有较强抗氧化活性的干酪乳杆菌FM-LP4，经过D-半乳糖诱导氧化损伤小鼠实验，发现FM-LP4能显著降低小鼠血清中内的毒素水平，这与其能够提高SOD、GPx的活力、抑制MDA的形成有密不可分的关系。

激活Nrf2/ARE通路需要3 步：1）拥有Nrf2稳定蛋白；2）Nrf2蛋白质转运到细胞核；3）Nrf2蛋白转录激活Nrf2靶基因。因此，可以用Nrf2靶基因的相对表达衡量Nrf2通路被活化的程度[22]。Nrf2/ARE通路的活化是由多种信号分子诱导的，Keap1使Nrf2阻遏蛋白在非胁迫条件下保持Nrf2活性，在发生氧化胁迫时调控Nrf2/ARE信号通路的激酶为：蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）促进Nrf2磷酸化，激活Nrf2/ARE信号通路；磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B作为细胞生长、增殖和细胞存活的关键信号轴也参与激活Nrf2/ARE信号通路；另外，MAPKs信号通路包括细胞外调节激酶ERK（extracellular signal-regulated kinase）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N terminal kinase，JNK）和p38 MAPKs，它们也是调节Nrf2信号通路的机制之一[23]。与其他激酶对Nrf2/ARE的调控相比，JNK发挥着较为主要作用，乳酸菌可能是通过诱导ASK激酶家族的表达激活JNK。Kobatake等[24]发现加氏乳杆菌SBT2055通过激活JNK信号促使Nrf2蛋白水平增加，然后上调其靶基因Sod1-3、Trx1、Hmox1和NQO1等的mRNA表达，增强抗氧化应激防御系统。

1.3 清除ROS和自由基

自由基主要在线粒体内产生，释放到细胞质中。乳酸菌会在自由基与机体内的大分子发生链式反应损伤细胞之前将自由基清除。机体中形成的自由基包括超氧阴离子自由基（O2－•）、H2O2、·OH、单线态氧（1O2）、氢过氧化物自由基（HOO·）等。1O2和H2O2通过Fenton反应生成活性最强的·OH，乳酸菌清除·OH的能力最强。另外，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基通过形成化合物，快速、直接地反映乳酸菌的抗氧化能力，是体外实验中常用的一个测定指标。Suo Huayi等[25]以清除DPPH自由基和·OH能力为指标来评价乳酸菌Zhao的抗氧化能力；Hashemi等[26]在研究酸奶的氧化稳定性时发现植物乳杆菌LS5的DPPH自由基清除率可以达到49.6%。

1.4 螯合金属离子

过量金属离子将氢过氧化物分解形成H2O2和烷氧自由基，使机体出现氧化损伤。金属离子会参与Fenton反应，生成引起脂质过氧化和DNA损伤的·OH。乳酸菌通过螯合金属离子，能够防止生成ROS，减少脂质发生氧化和DNA损伤的概率。Lee等[27]研究发现干酪乳杆菌KCTC 3260的完整细胞和无细胞提取物抑制脂质过氧化率分别为46.2%和72.9%，在其中并未检测到SOD，但螯合F e2+和C u2+的能力分别为1.0 6×1 0−5m g/L和2.18×10−5mg/L，说明干酪乳杆菌KCTC 3260抗氧化能力可能是通过螯合金属离子引起的，而不是通过提高SOD活力。Su Jing等[28]认为酒明串珠菌（Leuconostoc oenos）能够应对恶劣环境的原因之一是它能够螯合Fe2+。

1.5 产生抗氧化分子

乳酸菌被食用后会停留在肠道一定时间，通过代谢反应向细胞壁外分泌一些代谢产物如胞外多糖和生物活性肽，这些物质会发挥抗氧化作用，抑制脂质自由基连锁反应的发生[29]。胞外多糖是乳酸菌在代谢过程中产生的一种附着在细菌表面与细胞结合的多糖，或分泌到细胞壁外的黏液或荚膜多糖，由葡萄糖、甘露糖和半乳糖通过不同的配比组成，胞外多糖的抗氧化活性主要与其高级结构有关，具有一定空间结构的胞外多糖抗氧化作用更强[30]。抗氧化肽的活性取决于特定的氨基酸序列，通过以下途径发挥作用：2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐自由基清除剂的作用；抑制ROS生成；抑制炎性细胞因子的释放，如肿瘤坏死因子α（tumour necrosises factor α，TNF-α）和白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）[31]。另外，乳酸菌代谢中间产物也具有抗氧化作用，Furumoto等[32]发现肠道植物乳杆菌产生的亚油酸代谢衍生物长链脂肪酸KetoC由于具有α、β不饱和羰基基团，能够激活Nrf2通路并诱导抗氧化基因的表达，保护H2O2诱导的肝癌细胞HepG2免受细胞毒性的损伤。

2 乳酸菌抗氧化作用新的模型评价体系

乳酸菌抗氧化能力的判定主要是对菌体完整的细胞、发酵上清液和无细胞提取物进行研究，以螯合金属离子、清除自由基、抑制脂质过氧化、耐H2O2能力、抑制亚油酸过氧化和还原能力等为测定指标。Xu Shuang等[33]为了评估分离自中国传统发酵食品中乳酸菌的抗氧化活性，对菌株完整细胞和无细胞提取物清除·OH、螯合Fe2+的能力以及还原能力进行了测定。随着技术的发展和研究需求，几种新的方法被用于乳酸菌抗氧化能力的评定。

2.1 细胞模型评价体系

建立细胞模型是近年来发展起来的新的体外评价体系，直接以细胞为载体，未脱离机体本身，能更真实地反映氧化还原反应，在实际应用中可以直接检测到菌株的抗氧化能力，为乳酸菌抗氧化机制的研究奠定一定基础。Kuda等[34]为了研究分离自寿司的肠膜明串珠菌的抗氧化活性，构建了对小鼠巨噬细胞RAW264.7抗炎作用的模型，研究结果表明肠膜明串珠菌1R3M能够抑制大肠杆菌脂多糖产生NO、缓解结肠炎和腹泻，肠膜明串珠菌可以作为改善炎症的益生菌。Xing Jiali等[35]分别用清除DPPH自由基和建立细胞模型的方法评价了10 株乳酸杆菌的抗氧化能力，并对两种方法进行比较，结果发现，细胞模型是一种能够更好检测乳酸菌抗氧化活性的方法。Yu Xiaomin等[36]发现黏膜乳杆菌和植物乳杆菌能上调人结肠癌细胞HT-29和人克隆结肠腺癌细胞Caco-2中主抗氧化基因MT1、MT2等的表达，并提高抗氧化酶SOD、GPx等的活力。

2.2 动物模型评价体系

体外实验只能通过模拟机体内部的环境对乳酸菌的抗氧化特性进行初步评价，不能确定其在机体内部其是否能够同样发挥作用，因此需要建立动物模型测定血液或器官中的指标来验证乳酸菌缓解氧化应激的能力，如测定酶类抗氧化物质的变化、抗脂质水平以及MDA含量的变化[37]。Yadav等[38]将乳酸菌发酵食品低脂酸奶Dahi饲喂给高果糖诱导的糖尿病小鼠，记录在这一过程中肝脏和胰腺组织中氧化状态的硫代巴比妥酸和GSH的含量，结果显示氧化状态的硫代巴比妥酸含量降低，而GSH的含量明显升高，说明Dahi能改善大鼠的氧化应激水平。朱光华[39]发现干酪乳杆菌N2和植物乳杆菌X9能够提高高脂血症小鼠肝和肾组织中SOD和GPx的活力，降低MDA含量，并诱导抗氧化基因Nrf2的表达。Kumar等[40]用含有发酵乳杆菌RS-2的牛奶喂养糖尿病小鼠，发现小鼠肝脏和血液的血糖水平和脂质参数都有所下降，说明益生菌能缓解糖尿病的严重程度。

2.3 临床实验评价体系

人与动物的身体机能存在一定的差异性，要想确定基于体内外实验筛选的具有抗氧化能力的乳酸菌能否调节人体的氧化应激，需要通过临床实验对乳酸菌发酵制品进行验证，而临床实验可行性差且相对复杂，导致目前对于在临床上的研究主要集中在几株乳酸菌上，如乳酸双歧杆菌Bb12、干酪乳杆菌01等。发酵乳杆菌ME-3能降低血浆中氧化低密度脂蛋白，提高人体的总抗氧化能力，抑制动脉粥样硬化的产生[41]。Ejtahed等[42]将64 例II型糖尿病病人分为两组，干预组患者每天服用含有嗜酸乳杆菌LA5和双歧杆菌Bb12的益生菌酸奶300 g，而对照组每天服用300 g的常规酸奶，6 周之后，干预组患者红细胞中SOD和GPx活力增强，血清中MDA含量降低，总抗氧化能力增强。Asemi等[43]研究了益生菌酸奶对孕妇氧化应激水平的影响，70 名孕妇随机分为两组，以传统酸奶为对照，结果发现益生菌酸奶明显提高了红细胞GR水平，但对血浆GSH、红细胞GPx等其他氧化应激指标没有显著影响。然而Vaghef-Mehrabany等[44]却有不同发现，他们将46 例类风湿关节炎患者分为两组，益生菌组每天服用含有干酪乳杆菌01胶囊，对照组每天服用相同剂量麦芽糊精胶囊，8 周之后，对MDA含量、SOD、CAT活力等指标进行评估，发现各项指标没有显著性差异，说明益生菌不会影响人体健康。在未来的临床实验中，可以考虑采取较长时间的治疗，并调查不同剂量和不同种类的益生微生物对人体的影响。虽然在现有的一些实验中乳酸菌对于人体具有一定的抗氧化效果，但随着菌株种类、剂量以及作用时间的改变，还需要进行更深层次的研究。

3 抗氧化乳酸菌应用现状

乳酸菌经常在各种食品中被发现，包括肉、蔬菜、水果、乳制品，在呼吸道、肠道、污水、人类和动物生殖道以及植物原材料中也有存在，抗氧化活性乳酸菌能够通过发酵产品提高产品的风味、质地和货架期等，同时可以利用乳酸菌的生理功能，生产益生制品如抗氧化胶囊和片剂、保健品以及药品等。

Geeta等[45]利用植物乳杆菌对加入葡萄糖和淀粉的鸡肉进行发酵，发现其对·OH、O2－•、DPPH自由基清除能力增强，理化特性相对较好，脂质过氧化程度、微生物含量上有所降低。Zhao Huimin等[46]利用酵母菌和乳酸菌对小麦麸皮进行固态发酵，发现水溶性阿拉伯木聚糖含量比原料麸皮提高了3～4 倍，总膳食纤维和可溶性膳食纤维含量有所增加，超过20%的植酸被降解，抗氧化活性有所提高。Huang Li等[22]利用分离自内蒙古传统发酵豆腐的植物乳杆菌C88调控Nrf2/ARE通路，发现其能上调谷胱甘肽硫转移酶的表达以缓解氧化应激，同时下调细胞色素基因P4501A2和CYP3A4以防止黄曲霉毒素的形成。Ojekunle等[47]在进行利用分离自尼日利亚传统食品中的植物乳杆菌缓解重金属毒性研究时发现，服用植物乳杆菌的实验组能抵抗铅和铬对小鼠造成的肾和肝功能损伤。木薯发酵食品是巴西土著人的传统制品，Freire等[48]的实验首次以木薯和大米为原料，使用植物乳杆菌和酵母对其进行发酵，生产非乳制发酵饮料，发现其矿物质含量丰富、感官性能良好，产品的消化率有所提高。单闯[49]用瑞士乳杆菌发酵液（NS8-fermented milk supernatant，NS-FS）延缓皮肤光衰老，发现NS-FS能提高紫外线诱导损伤小鼠的抗氧化酶水平，诱导Nrf2蛋白表达，对紫外线致皮肤衰老有干预作用。Dawood等[50]利用鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌或者两种菌的混合物制品饲喂给真鲷苗种56 d后，发现与使用单一菌株相比，使用两者的混合物能够显著提高血浆总蛋白含量、Prx和SOD的活力，降低总胆固醇和甘油三酯的含量，说明两者的混合物能够有效提高真鲷的免疫力和抗氧化活性。

4 结 语

我国乳酸菌菌种资源丰富，为开发天然抗氧化剂提供了有利条件。乳酸菌的抗氧化活性自20世纪90年代被发现以来，一直是各个领域学者研究的热点。乳酸菌可以通过清除自由基、提高抗氧化酶的活力、降低MDA含量、调控相关信号通路等发挥抗氧化作用，通过对乳酸菌抗氧化调控体系的研究，简化抗氧化乳酸菌的筛选过程，有助于功能性食品和新型药品的开发，为相关疾病的治疗提供了新思路。然而其抗氧化机制依然没有有效地建立起来，这将是未来几年抗氧化乳酸菌研究的热点。在评价体系方面，细胞代谢组学与使用动物血清、组织或体液来评价抗氧化活性相比方便快捷、可控性强，与细胞学评价方法相比，能全面表明细胞内的生物学信息，因此细胞代谢组学的建立能帮助我们更加清晰地了解乳酸菌的抗氧化特性。总之，随着乳酸菌抗氧化特性研究的深入和科研工作者对乳酸菌关注的增多，乳酸菌抗氧化产品必将在功能性食品和药品中占据主要地位。