咀嚼力对青龄期大鼠牙槽骨胰岛素样生长因子-1、骨保护素、核因子kB受体活化因子配体蛋白表达的影响

李淑娴，马宗民，孙雨辰，王学金

（1.大连大学 机械工程学院，辽宁 大连 116622；2.大连大学 研究生院，辽宁 大连 116622；3.大连大学附属中山医院，辽宁 大连 116601）

0 引言

颌骨作为颌面部的骨性支架，构成颌面部轮廓外形，具有与咬合、咀嚼、语言和保持呼吸道畅通等生理功能。骨组织有力学适应性，颌骨为承受咀嚼载荷的骨器官，它的生长发育除受到遗传因素影响外，还与所处的力学环境密切相关。骨在整个生命过程都在不断的重建中,颌骨骨代谢活跃、骨转换率高。力学信号转导是骨重建的关键环节,是当前的研究热点[1]。研究发现，骨重建受到胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、骨保护素（OPG）/核因子kB受体活化因子配体（RANKL）等多种分子信号系统的调控，并且不同分子信号系统之间存在协同关系[2-8]。力学信号转导多见体外实验研究，体内动物实验研究IGF-1、OPG/RANKL及其关系的暂不多见。本研究通过喂食不同硬度的饲料，建立不同强度力学刺激SD大鼠牙槽骨动物模型，分析不同强度力学刺激对牙槽骨微结构、IGF-1、OPG和RANKL表达的影响及它们之间的关联性，探讨力学信号在骨重建中的传递，揭示颌骨力学适应性的机制，深入研究颌骨骨重建，对口腔相关领域有一定的临床意义。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雌性SD大鼠，健康、牙列完好，2月龄，体重200～240 g，大连医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证（SCXK（辽）2008—0002）。

1.2 试剂与仪器

PVDF 膜 (美 国 Millipore公 司 )；IGF-1、OPG、RANKL和β-actin抗体（Abcam 公司）；辣根过氧化物酶标记的抗兔及抗鼠二抗(Santa Cruz生物工程公司)；细胞培养箱、超净台(美国Forma Scientific公司)；低温离心机(德国Sigma公司)；PERFECTION1270凝胶影像分析仪(美国)；Nikon300型自动摄像倒置显微镜(美国Nikon公司)；电子天平(德国Sartorius公司)，微量加样器（法国Gilson公司），去离子水仪（美国PALL,Purelab Plus公司）等。

1.3 实验方法

1.3.1 分组与处理

40只雌性SD大鼠随机平均分为：软食组、硬食组。饲料在江苏省协同医药生物工程有限责任公司定制，营养成分一致（符合标准GB14924.3-2010）。大鼠适应性常规喂养1周后开始分级喂养。两组大鼠在分级喂养2月、4月分两次处死，取两侧下颌骨，剔除软组织后一侧下颌骨置入10%中性福尔马林液中浸泡固定，另一侧置入-80℃冰箱保存，备用。

1.3.2 指标检测与方法

（1）骨组织形态计量学指标检测

利用Siemens Inveon MultiModality System显微CT机扫描重建大鼠下颌骨，扫描条件为：电压80 kV、电流450 μA、分辨率15.48 μm，检测骨体积分数(BV/TV)，骨小梁数量(Tb.N) ，骨小梁分离度(Tb.Sp)，骨小梁厚度(Tb.Th)等骨形态计量学指标。

（2）IGF-1、OPG和RANL蛋白表达检测

Western blot测定下颌骨第三磨牙区牙槽骨组织中OPG、RANKL蛋白表达：将组织研碎、裂解提取组织蛋白。采用10%SDS-PAGE电泳分离，转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭，4℃孵育一抗过夜，漂洗充分后孵育二抗，免疫反应条带用ECL法显影，UVP分析仪(PERFECTION1270) 扫描曝光胶片。采用Image-Pro Plus软件进行灰度测定，分析蛋白相对表达量，目的蛋白的相对表达水平＝目的蛋白灰度值／内参灰度值，以3次重复检测所得平均值为该样本目的蛋白表达水平

1.4 统计学分析

所得数据以均值±标准差表示，应用SPSS18.0进行独立变量T捡验，设定P＜0.05差异具有显著性；Spearman 线性相关分析。

2 结果

2.1 骨形态计量学指标

表1和表2是分别是下颌骨第三磨牙区骨形态计量学指标检测结果。从结果可以看出，两个测试时间点大鼠牙槽骨骨体积分数、骨小梁数量硬食组均较软食组同时上调，差异有统计学意义（P＜0.05）；骨小梁分离度硬食组较软食组降低,差异有统计学意义（P＜0.05）；软食组4月结果与2月结果相比，骨体积分数降低，骨小梁分离度升高；硬食组4月结果与2月结果相比，骨体积分数降低，骨小梁分离度升高。

表1 喂食2个月大鼠下颌骨显微CT检测结果

表2 喂食4个月大鼠下颌骨显微CT检测结果

2.2 IGF-1、OPG和RANKL蛋白表达

表3和表4是分别是下颌骨第三磨牙区IGF-1、OPG和RANKL蛋白2月、4月表达检测结果。从结果可以看出，两个测试时间点大鼠牙槽骨中IGF-1和OPG表达硬食组均较软食组同时上调，差异有统计学意义（P＜0.05），两种蛋白浓度呈正相关，相关系数为0.884；RANKL表达硬食组较软食组降低,差异有统计学意义（P＜0.05）；IGF-1和RANKL两种蛋白浓度呈负相关，相关系数为-0.913；软食组4月结果与2月结果相比，IGF-1蛋白表达升高，不显著（P＞0.05）；OPG蛋白表达降低，不显著（P＞0.05）；RANKL蛋白表达降低，不显著（P＞0.05）；硬食组4月结果与2月结果相比，IGF-1蛋白表达升高，不显著（P＞0.05）；OPG蛋白表达降低，不显著（P＞0.05）；RANKL蛋白表达升高，不显著（P＞0.05）。

表3 喂养2个月IGF-1/OPG/RANKL蛋白检测结果（X±S）

表4 喂养4个月IGF-1/OPG/RANKL蛋白检测结果（X±S）

3 讨论

骨组织有适应力学环境的能力，称为骨的力学适应性。骨组织能够顺应力学环境的变化进行骨量的调整，适度的力学刺激能够促进骨的生长，增加骨量。骨体积分数、骨小梁宽度、骨小梁数量、骨小梁分离度是重要的骨形态计量学指标。研究发现较强的力学刺激能够促进牙槽骨的生长[22-23]，骨体积分数、骨小梁数量增加，骨小梁分离度降低。本研究亦证实这一点。

骨的力学适应性过程主要分为3个环节：宏观学力信号转化为微观力学信号；微观力学信号转化为生化信号；生化信号传递到传感细胞。力学信号转化为生化信号是关键环节。颌骨承受牙齿传递的咀嚼载荷，骨重建活跃。骨重建受到多种生化分子系统的调节。研究表明，IGF-1、OPG/RANKL均为应力敏感的分子系统[7-12]。

IGF-1是骨组织中的一种局部效应分子，能够促进成骨细胞的增殖与分化，对骨的生长发育具有调节作用[10,21]。研究发现在肌肉和骨骼中IGF-1的表达会受到应力的调控[11]。鲜成玉等体外实验也证实了拉伸力学刺激能够促进IGF-1的表达，认为IGF-1是受应力调控的敏感因子。本研究结果显示，SD大鼠牙槽骨中硬食组IGF-1蛋白表达量高于软食组，说明高咀嚼力刺激能够促进牙槽骨中IGF-1的表达。这表明，不论体外还是体内，力学刺激均能促进IGF-1的表达，更证实了IGF-1为应力敏感因子。

OPG-RANKL-RANK是调节骨重建的关键信号通路[13-15]，成骨细胞和骨髓基质细胞分泌OPG 和RANKL；RANKL与破骨细胞前体细胞和破骨细胞表面的RANK 结合后，将信号传入细胞内，刺激破骨细胞的形成和成熟，促进骨吸收；OPG与RANKL竞争性结合，减少了RANKL同RANK的结合，抑制破骨细胞分化成熟。从而竞争性减少了RANKL同RANK 的结合，阻断骨吸收信号传递，抑制破骨细胞分化成熟，抑制骨吸收；骨组织局部微环境中的OPG、RANKL或RANK表达水平，可能是决定破骨或成骨平衡的关键。很多研究证实，力学刺激能够调节OPG、RANKL的表达[15-19]。本实验结果显示，SD大鼠牙槽骨中硬食组OPG蛋白表达量高于软食组，硬食组RANKL蛋白表达量低于软食组。这表明，咀嚼力对OPG/RANKL蛋白表达有影响，可以调控OPG/RANK/RANKL信号通路。

有研究认为，OPG/RANKL/RANK是参与骨重建的关键分子信号系统，体内诸多激素和因子可通过影响OPG或RANKL的表达来影响骨重建，将不同因素的影响转化为适当的RANKL和OPG产出，从而对骨重建进行调控[11]。骨重建的平衡受多条信号通路调控，各条通路之间协同作用，互相影响[20-21]。本研究显示，大鼠牙槽骨中IGF-1和OPG两种蛋白浓度呈正相关；IGF-1和RANKL两种蛋白浓度呈负相关，证实了不同信号通路之间的关联性。

本研究硬食组4月结果与2月结果相比，IGF-1蛋白表达升高；OPG蛋白表达降低，RANKL蛋白表达升高，IGF-1还未达到峰值，OPG/RANKL已达到峰值，开始向相反方向回调。这表明，IGF-1与OPG/RANKL对力学刺激的响应或许有差异。有研究认为[20]，力学刺激强度、频率和持续时间均可能是影响OPG、RNAKL表达的重要因素，即适宜的力学刺激提高OPG表达抑制RANKL 表达，促进成骨作用；而过度力学刺激则会抑制OPG表达，提高RANKL表达。本研究或许从这里可以得到解释。

本文研究了不同咀嚼力对青龄期SD大鼠牙槽骨IGF-1、OPG和RANKL蛋白表达的影响并研究了它们之间的关系，探讨了咀嚼力在牙槽骨骨重建中的传递，有助于揭示牙槽骨骨重建的力学适应性机制，为生物力学方法防治颌骨骨代谢相关疾病提供理论指导。骨重建除受到IGF-1、OPG/RANKL信号通路的调节，还有其它信号通路，它们对力学刺激强度、频率和持续时间的响应是否一致，它们之间的协同作用是怎样的如何产生的，是否有信号通路起主导作用，还需进一步的研究。