基因dat对单核细胞增生李斯特氏菌的生物学特性影响

曾海娟， 谢曼曼， 丁承超， 刘武康， 董庆利， 刘 箐

(上海理工大学 医疗器械与食品学院，上海 200093)

单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)是革兰染色阳性的一种重要的食源性致病菌，广泛分布于土壤、污水等环境中[1]。Lm具有较强的生存能力，pH在4.5～9.0，温度在0～45 ℃均可增殖[2]，在冰淇淋、原奶、生肉、干酪、海鲜及方便食品，如熟肉、熏鱼中均有检出[3-6]。由于食用了被污染的食物导致单增李斯特菌的感染[7]，患者死亡率可达30%以上。单增李斯特菌是典型的细胞内寄生菌，可通过李斯特菌溶血素等的裂解作用下逃离吞噬小体[8-9]，进入并在细胞质中增殖，在其中产生的蛋白将激活CD8+T细胞，部分被吞噬溶酶体直接杀死，降解的蛋白呈递给CD4+T细胞。Lm引起的独有的这种功能免疫应答机制，使得减毒李斯特菌成为一种潜在的可携带肿瘤、病毒及细菌抗原的疫苗载体[10]。 基因dat(daaA)存在于多种细菌中，其编码D-丙氨酸氨基转移酶蛋白，经转氨作用可将D-谷氨酸转变为D-丙氨酸(D-Ala)，后者为细菌细胞壁肽聚糖的重要组成成分[11]。在单核细胞增生性李斯特菌中，存在两种途径生成D-Ala：基因dal编码丙氨酸消旋酶(Alr)，可将L-Ala转化为D-Ala；基因dat编码D-氨基酸氨基转移酶蛋白，可将D-谷氨酸与丙酮酸通过转氨作用生成D-Ala与α-酮戊二酸，当dat与dat基因全部缺失时，由于不能产生D-Ala，在无外源D-Ala添加时，该dat/dat双基因缺失菌株将发生溶菌死亡[14]。当菌株缺失dat基因时，该缺失菌株在生长状态、毒力基因表达水平、细胞侵袭性、生物被膜的生成量等方面的影响目前尚无研究报道。 作为一种潜在的疫苗载体，对李斯特菌进行减毒以保证安全性就显得尤为重要。本研究以单增李斯特菌野生株EGDeactA及inlB双基因缺失株(EGDe ΔactAΔinlB)为材料，利用同源重组的方法构建缺失了dat基因的菌株(EGDeΔactAΔinlBΔdat)，并对构建的该缺失菌株的生长状态、毒力基因表达水平、细胞侵袭性及生物被膜的生成量等方面做进一步分析。该项研究对菌株EGDeΔactAΔinlBΔdat的特性提供了参考，为研究dat基因的功能提供了材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 单增李斯特菌野生株EGDe、穿梭质粒pKSV7由上海交通大学史贤明教授赠予，EGDeΔactAΔinlB由本实验室构建，大肠埃希菌(Escherichiacoli)DH5α感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.2 主要试剂与仪器 胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；PCR相关试剂、RT-PCR相关试剂、DNA连接酶、限制性内切酶，TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司；脑心浸液培养基(BHI)，北京陆桥技术有限公司；氨苄青霉素、氯霉素及其他常规试剂，国药集团化学试剂有限公司；PCR热循环仪、荧光实时定量PCR仪，Applied Biosystems公司；凝胶成像仪、Thermo浓度测定仪，美国Thermo基因有限公司；Mini-power电泳仪、电穿孔仪，美国伯乐公司；SpectraMax M2多功能酶标仪，美国分子仪器公司。

1.1.3 引物 根据GenBank登录的基因序列(登录号Gene ID：985722NC_003210.1)，用Primer3 Input设计扩增上游同源臂引物P1/P2，下游同源臂引物P3/P4。连接后PCR引物为P1/P4，全长1 980 bp，缺失片段大小为839 bp。相关引物序列见表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR扩增所用的引物序列

1.2 方法

1.2.1 基因缺失株的构建 ①穿梭重组质粒的构建：引物P1/P2及P3/P4分别用于扩增dat基因的上下游同源臂，扩增片段分别经BamH I 单酶切后16 ℃过夜连接约16 h，以引物P1/P4对连接产物进行扩增，后经DNA回收试剂盒割胶纯化回收，再经SalI与SmaI 酶切。酶切片段经琼脂糖电泳后割胶纯化回收，与经SalI与SmaI酶切的穿梭质粒pKSV7连接，并转化至大肠埃希菌DH5α中，涂布含氨苄青霉素(100 μg/mL)的LB固体培养基培养。②电转化与同源重组：引物P1/P4对LB平板上的单菌落进行PCR鉴定。鉴定为阳性的克隆抽提质粒后送华大基因测序。测序正确的重组质粒经12.5 kV/cm、3 ms电转化至EGDe ΔactAΔinlB中，涂布含氯霉素(10 μg/mL)的抗性平板培养24～48 h，引物P1/P4对平板上的单菌落进行鉴定。鉴定为阳性的克隆在41 ℃和氯霉素双重压力下传8代，然后在30 ℃无抗性条件下传6代，末代培养物在无抗性BHI平板上划线。③缺失株的鉴定：挑取BHI平板上的单菌落于液体培养基培养，分别用引物P1/P4及tF/tR进行PCR鉴定，鉴定成功的菌株分别划线于BHI平板及含氯霉素(10 μg/mL)抗性平板，37 ℃培养。

1.2.2 缺失株生长曲线测定 利用酶标仪对EGDe ΔactAΔinlB及EGDeΔactAΔinlBΔdat的生长能力进行测定。挑取BHI平板上的单菌落37 ℃过夜培养后，按1∶100转接到新鲜的液体培养基中，37 ℃摇床培养。每间隔1 h吸取样品于96孔微孔板中，酶标仪测定600 nm处的吸光度光密度值(OD值)后继续37 ℃摇床培养，连续测12 h。

1.2.3 毒力基因表达水平的检测(RT-PCR) 为确定该基因对其他毒力基因及dal表达量的影响，本实验比较了两株菌在多个基因表达量上存在的差异。分别挑取EGDeΔactAΔinlB及EGDe ΔactAΔinlBΔdat平板上的单菌落过夜培养后，各取5 mL饱和菌液提取RNA后，按照TaKaRa反转录试剂盒的操作说明先去除其中的DNA，再反转录为cDNA。以cDNA为模板进行qRT-PCR，实验中所用的其他毒力基因引物见表2。

表2 qRT-PCR所用的引物序列

1.2.4 生物被膜的形成量 构成生物被膜的胞外多糖可与结晶紫结合，可利用胞外多糖的量来衡量生物被膜的生成量。将过夜培养的细菌用新鲜的BHI液体培养基调整至OD600为0.15，取200 μL加入96孔细胞培养板中，37 ℃培养48 h。无菌PBS洗3遍后，1%的结晶紫染色30 min，无菌水洗3遍，每孔滴加95%乙醇洗脱30 min，利用酶标仪测量其在570 nm下的吸光度值。

1.2.5 细胞侵袭实验 将生长良好的Caco-2细胞消化并转移至12孔细胞培养板中，过夜培养。细菌侵袭前，以感染复数MOI=100∶1的比例加入新鲜的待测菌液共培养2 h。侵袭结束后，换用庆大霉素(200 μg/mL)37 ℃处理30 min。将庆大霉素吸出，无菌生理盐水轻柔清洗2次，1% Triton X-100裂解细胞，每孔充分吹打并收集至离心管中，生理盐水梯度稀释涂布BHI平板，置于37 ℃培养箱培养并计数。

2 结果与分析

2.1 上下游片段扩增及连接

上下游同源臂片段经1.5%琼脂糖凝胶电

泳，条带大小分别在980 bp和1 000 bp左右(图1a)，连接后产物经电泳，显示一条约1 980 bp的条带(图1b)，与预期结果一致。

图1 上下游同源臂及连接后PCR扩增结果Fig.1 The PCR amplification results of upstream and downstream homologous arm and after connecting a1：上游同源臂；a2：下游同源臂;b：上下游连接后扩增片段;M1：DL 1 000 bp marker；M2：DL 2 000 bp markera1: Upstream homologous arm; a2: Downstream homologous arm; b: Amplified fragment after upstream and downstream homologous arm connecting; M1: DL 1 000 bp marker; M2: DL 2 000 bp marker

2.2 穿梭重组载体构建

连接片段经SalI及SmaI酶切后，与同样经酶切的穿梭质粒pKSV7连接，并转化至大肠埃希菌DH5α中。阳性克隆抽提重组质粒测序成功后，经双酶切鉴定，可见1 980 bp左右的片段，大小与预期一致(图2a)，表明重组质粒构建成功。重组质粒电转化鉴定结果如图2b，可见1 980 bp左右的条带(泳道3、4)，表明重组质粒成功电转化至EGDeΔactAΔinlB中。

图2 鉴定结果Fig.2 Identification results a：双酶切鉴定结果； b：电转化鉴定结果； M1：DL 10 000；M2：500 bp marker；b1～b4：单菌落a: Identification of double digestion; b: Identification of electrotransformation； M1: DL 10 000 bp marker; M2: 500 bp marker; b1-b4: Monoclonal strains

2.3 缺失株的鉴定

引物tF/tR的结合位点位于缺失的839 bp的序列上，若dat基因被敲除，则该引物将不能扩增出条带。鉴定时，分别采用引物P1/P4及tF/tR对单菌落PCR扩增，若P1/P4扩增出1 980 bp左右的条带，而tF/tR未扩增出条带，则该菌株为疑似敲除菌株。如图3a(1～2)所示，引物P1/P4扩增出1 980 bp左右的条带；如图3b(1～2)所示，引物tF/tR未扩增出条带，表明1、2号为疑似敲除株，经氯霉素抗性进一步鉴定，该克隆不能在抗性平板上生长，确定为敲除株。

图3 基因缺失株的鉴定Fig.3 Identification of gene deletion stain a：引物P1/P4扩增产物； b：引物tF/tR扩增产物； 1～2：单克隆菌株；3：阴性对照；4：阳性对照； M1：500 bp marker；M2：DL 1 000 markera: PCR products of P1/P4 primers； b: PCR products of dat-F/dat-R primers 1-2: monoclonal strains; 3: Negative control; 4: Positive control; M1: 500 bp marker; M2: DL 1 000 marker

2.4 生长曲线测定

酶标仪测定12个时间点的600 nm处的光密度值绘制生长曲线，如图4所示，与亲本株EGDeΔactAΔinlB相比，敲除株EGDeΔactAΔinlBΔdat培养5～8 h的菌浓度低于亲本株(P<0.01)，而在10 h后达到的菌浓度与亲本株相同。表明dat基因的缺失使菌株通过另一途径经丙氨酸消旋酶作用产生D-Ala，但在菌株快速增长的对数期，单一基因产生的D-ala不足以维持菌株生长需要，因而对数期菌浓度低于亲本株。

图4 生长曲线Fig.4 Growth curve **：差异显著(P<0.01)；***：差异显著(P<0.001)，下图同 **: Significant difference (P<0.01); ***: Significant difference (P<0.001)，same the follow

2.5 毒力基因的相对表达量

本实验选取了李斯特菌EGDe的12个毒力基因及与D-Ala合成有关的2个基因，比较EGDe ΔactAΔinlB与EGDe ΔactAΔinlBΔdat在基因表达量上存在的差异，其中以EGDe ΔactAΔinlB的基因表达水平为对照组，即EGDeΔactAΔinlB的每个目的基因表达水平均以1表示，EGDe ΔactAΔinlBΔdat的目的基因表达水平大于1为表达上调，反之则为表达下调。由图5，可知菌株EGDe ΔactAΔinlBΔdat的dat基因无信号，进一步验证dat基因的缺失；EGDe ΔactAΔinlBΔdat与EGDeΔactAΔinlB相比，基因srtA、plcA表达量下调(P<0.01)，VIP、inlA基因表达上调(P<0.01)。

图5 qRT-PCR结果Fig.5 Results of qRT-PCR

2.6 生物被膜的生成量

生物被膜是细菌抵抗外界不利环境时形成的，它是一种多细胞聚合物，由细菌团块与表多糖、蛋白和胞外DNA构成的细胞外基质形成的复合物。由图6可知，与亲本株EGDe ΔactAΔinlB相比，dat基因的缺失使得菌株形成生物被膜的能力显著增加(P<0.01)，而在培养基中添加D-Ala的缺失株菌膜生成量与EGDe ΔactAΔinlB相比无显著差异，推测由于dat基因的缺失使菌株处于D-Ala营养不足的胁迫状态，因而对于外界不利条件形成自我保护的生物被膜。

图6 生物被膜生成量比较Fig.6 Comparation of biofilm

2.7 细胞侵袭结果

由Caco-2细胞侵袭结果(图7)可知，敲除actA及inlB基因后，菌株EGDe ΔactAΔinlB的侵袭能力显著下降(P<0.05)，表明actA及inlB基因在细胞侵袭过程中发挥了重要作用。缺失dat基因，并未对侵袭结果产生显著影响，表明dat基因敲除后，菌株的侵袭能力并无发生变化，也不会引起菌株毒力返祖的现象。

图7 细胞侵袭结果Fig.7 Results of cell infection *：差异显著(P<0.05) *: Significant difference (P<0.05)

3 讨 论

作为一种胞内寄生的模式菌，阐明 Lm 致病的分子机制对于研制具有应用前景的弱毒疫苗和活疫苗载体具有十分重要的意义。相关报道表明，单增李斯特菌识别、黏附与侵入宿主细胞的过程与内化素基因(inl)编码的内化素A和B有关[18-19]，而其在细胞间运动及扩散由毒力基因plcA、plcB、hly、actA等介导[20-22]。根据文献，单增李斯特菌dal/dat双基因缺失株的毒力将明显减弱，与野生株相比，对小鼠的半数致死率可提高4个数量级[23]。本研究在单增李斯特菌actA及inlB双基因缺失株的基础上，利用同源重组成功构建了dat基因缺失的三基因缺失株，并对该缺失菌株的生长特性状态、毒力基因表达的变化、生物被膜的生成量及对细胞的侵袭性进行了研究。结果显示，缺失dat基因的菌株在无外源D-Ala补充时虽能生存，但缺失株对数期的菌浓度显著低于EGDe ΔactAΔinlB(P<0.01)，可能由于dal基因产生的D-丙氨酸的量不足以维持菌株快速生长的需要，因而对数期的菌浓度低于亲本株。RT-PCR结果显示，与亲本株EGDe ΔactAΔinlB相比，基因srtA、plcA表达量下调(P<0.01)，VIP、inlA基因表达上调(P<0.01)。缺失株菌膜生成量显著增加(P<0.01)，培养基中添加D-Ala后菌膜生成量与亲本株相比无差异，表明基因dat缺失使菌株处于一种外界营养胁迫状态。缺失株对Caco-2细胞的侵袭与亲本株相比无显著差异。本研究表明基因dat在菌株生长及菌膜生成上起重要的调控作用，但不会影响菌株毒力。

在革兰阳性菌，如鼠伤寒及猪霍乱沙门氏菌中[24]，同样存在类似功能的基因—asd基因，编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶。asd缺失菌株在无外源二氨基庚二酸存在的条件下会发生溶菌死亡，通过质粒回补asd基因并携带外源抗原基因而表达相应抗原蛋白，能有效解决质粒携带外源基因表达不稳定的问题，为沙门氏菌活疫苗载体的研发开辟了新的途径。由于单增李斯特菌中存在两个功能类似的基因dal与dat，而由本研究表明，单独缺失dat基因并不能构建李斯特菌的营养缺陷体，的因而下一步计划是在本研究的基础上进一步缺失dal基因，通过质粒回补dal或dat基因并携带外源抗原基因，构建能稳定表达外源基因的单增李斯特菌活疫苗载体。该项研究通过对缺失株生长特性、基因的相对表达量、生物被膜的生成量及对细胞的侵袭性的研究，为基因dat缺失后菌株的生物学特性提供依据，并对进一步缺失dal基因，构建李斯特菌活疫苗载体提供参考。