针刺嗅三针对帕金森病小鼠嗅球病理及黑质TH表达的影响

王 强，刘智斌，王 渊，李 杰，鲁 刚，马 雪，郭 阳

(陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046）

我国目前正进入老龄化社会，帕金森病（PD）作为神经内科常见病在老年人中的发病率逐年提高[1-3]。许多帕金森病人在早期，路易小体首先会影响嗅觉系统，如嗅球或嗅前核，导致病人嗅觉障碍[4]。按Braak病理分期，典型的运动症状在三期以后才会出现，而之前的非运动症状容易被忽视，有学者[5-6]甚至认为，以嗅觉障碍为主的非运动症状可以被视作早期帕金森病发生的生物学标志。脂多糖（LPS）是内毒素的主要成分，也是一种革兰氏阴性菌。研究[7-9]表明，LPS可以激活小胶质细胞，也可以导致黑质多巴胺能神经元丢失。“嗅三针”疗法对神经退行性病变疾病的相关临床症状和嗅觉功能障碍均有较好的改善作用。“嗅三针”疗法是刘智斌教授课题组多年来用于治疗神经退行性病变的一种特色电针疗法，尤其对嗅觉功能障碍具有较好的改善作用。本实验通过经鼻灌注LPS的方法建立小鼠PD模型，期望能从病理学及行为学角度揭开针刺经鼻防治帕金森病的治疗思路，为临床诊治提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 清洁级健康雄性C57BL /6 小鼠40只，随机分为空白组（Sham），帕金森模型组（Model），帕金森模型+嗅三针干预组（XSZ），左旋多巴组（L-DOPA），每组10只。

1.2 试剂与仪器 TH免疫组化试剂盒（Sigma公司）；生物素化山羊抗兔IgG（中山金桥生物有限公司）；BA200Digital数码三目摄像显微摄像系统（麦克奥迪实业集团有限公司）；2015型转轮式切片机；PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪（常州市中威医疗仪器有限公司）；Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统（美国Media Cybernetics公司）。

1.3 嗅觉障碍模型 实验动物及模型制备：健康雄性C57BL/6小鼠，10月龄，体质量22～25 g，由西安交通大学动物实验中心提供，清洁级饲养，自由饮食1 周。气体乙醚麻醉小鼠后，将小鼠鼻孔暴露，然后用移液枪将LPS（1 g/L，溶于生理盐水）少量滴入小鼠鼻孔内，防止吸入呼吸道，并尽量使LPS在鼻腔吸收，一侧鼻孔10 μL，2次/d，持续1月。空白组滴入同样体积的生理盐水[10]。干预处理完毕后将上述2组大鼠分别放入笼中继续饲养。

1.4 电针及西药干预方法 “嗅三针”定位，印堂穴：在小鼠两眼中点偏上2 mm 处。迎香穴：小鼠鼻孔外侧上端，有毛与无毛交界处。电针方法：所有穴位向内上方斜刺0.3 cm。电针参数：1 mA， 疏密波；正极和负极各接一侧迎香穴，刺激时间10 min，1次/d。电针干预在造模开始后第1天进行。5 d为1疗程，休息2 d，共进行2个疗程。左旋多巴配制：注射液配制成10 mg/mL（左旋多巴10 mg/kg，苄丝肼2.5 mg/kg，溶于0.9%生理盐水），腹腔注射。

1.5 行为学指标观察 嗅觉障碍测试方法：改良食物小球埋藏实验。将食物小球埋藏在垫料中，位置随机选择，深度为1 cm左右。实验前1 d同一时间开始，小鼠断粮不断水，第2天上午和下午同一时间分别将实验小鼠投入实验场所中，300 s内（取2次测试平均值）未找到食物小球的小鼠判定为嗅觉功能失常。

帕金森行为学评估采用足迹分析及游泳实验评分方法：1）足迹分析方法：自制50 cm×10 cm×20 cm的通道，用相同尺寸的白纸铺在通道的底部，首先对小鼠进行训练，测量其步长，然后将小鼠后脚掌涂上墨汁，待其穿过通道后，测量小鼠同侧脚印距离，并取平均值。2）游泳实验方法：将小鼠放入30 cm×20 cm×20 cm的水箱中测试游泳指数，水深为15 cm，水温27 ℃。评分标准：3 分，3 min 内连续不断的游泳； 2 分，大部分时间游泳； 1 分，偶尔游泳；0 分，四肢无活动。

1.6 组织取材方法 疗程结束后实施组织取材，参考The Rat Brain嗅球采集方法：采用电钻在前囟前3.2 mm为后界开窗，使左侧嗅球暴露，继而从后界垂直插入取出嗅球，留作HE染色用。然后迅速分离腹侧中脑（黑质区及腹侧被盖区），按照常规免疫组化方法处理，留做免疫组织化学实验用。

1.7 大脑黑质TH表达检测方法 按照常规免疫组化方法处理，包括载玻片防脱片处理、脱蜡、热修复抗原、山羊血清封闭液；滴加1:200的一抗后，4 ℃孵育过夜。次日，PBS洗3次后滴加山羊抗鼠/兔IgG二抗，PBS洗后使用DAB试剂盒显色；最后至苏木素复染、脱水、透明及封片。

1.8 图像采集 图像采集应用显微摄像系统，对于采集组织的所有切片，先将其置于100倍镜下进行观察，其次参照黑质组织表达情况进行图像采集，选取1个区域进行镜下400倍观察。

1.9 统计学方法 测定目标图像的平均光密度值，应用SPSS 17.0 统计分析软件，采用单因素方差分析（oneway ANOVA），所有数据以均数±标准差（x± s）表示。

2 结果

2.1 各组大鼠行为学测试结果 见表1，表2。

表1 各组大鼠嗅觉测试实验结果（x± s ，n = 10）s

表1表明，在埋藏小球实验中，与正常对照组相比，LPS组与左旋多巴组小鼠找寻食物的时间均超过300 s，差异具有统计学意义（P＜0.01），可以判定为嗅觉功能减退或丧失。与LPS组比较，“嗅三针”干预组小鼠找寻时间减少，差异具有统计学意义（P＜0.01）；左旋多巴组小鼠找寻时间＞300 s，嗅觉功能障碍未改善。

表2 各组大鼠PD行为学测试结果（x± s ，n = 10）

表2表明，在PD行为学测试实验中，与正常对照组相比，LPS组小鼠步长及游泳时间均减少，差异具有统计学意义（P＜0.01）。与LPS组比较，“嗅三针”干预组小鼠步长和游泳的时间都增加，差异具有统计学意义（P＜0.01）；左旋多巴组小鼠的步长和游泳时间也得到了改善，与模型组相比，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 各组大鼠嗅球病理改变 见图1。

图1 各组大鼠嗅球病理改变（×400）

图1 所示，正常组小鼠嗅球的组织层结构分界清晰，呈同心圆状整齐排列；而PD模型组嗅球组织层结构分界不清晰，细胞层排列紊乱，部分细胞聚集，其中可见炎性细胞浸润，与正常组小鼠比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）；嗅三针组与模型组相比则显著降低了炎性细胞的浸润，嗅球的显微结构分界清晰，与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）；左旋多巴组细胞层排列紊乱，可见大量炎症细胞浸润，与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 各组大鼠黑质中TH的表达（免疫组化染色） 见图2。

图2 各组大鼠黑质中TH阳性表达灰度值（IHC×400）

图2 所示，模型组和空白组比较，黑质中TH阳性表达均显著低于空白组（P＜0.05），电针嗅三针组显著提高了TH在中脑黑质中的表达（P＜0.05），左旋多巴组与电针组效果相当，与模型组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

帕金森病（PD）目前作为临床常见神经退行性疾病，其标志是黑质纹状体多巴胺的缺失，以及残留神经元细胞质内出现的路易小体（LB）。其主要表现为锥体外系运动障碍，表现为肌僵直、静止性震颤、运动迟缓及步态异常等。有研究[11-12]表明，多巴胺不仅存在于黑质-纹状体系统，而且也分布在嗅球等部位，所以有许多帕金森病患者不仅患有嗅觉障碍，而且有可能会早于运动症状出现。笔者在动物行为学实验中发现，LPS在引起帕金森病运动症状的同时也会导致嗅觉障碍，而早期针灸干预的介入不仅可以改善嗅觉行为障碍，还可以对PD行为学障碍有改善作用。

脂多糖（LPS）作为自然界中存在的物质，常会被空气中的污染物质裹挟，经过鼻腔避开血脑屏障后，进入脑内从而诱发PD。研究[13]证明，LPS经鼻暴露不仅能触发嗅觉上皮细胞的炎症反应，还会使嗅觉神经元丢失，这可能是PD患者早期嗅觉减退的重要诱因。另外，研究显示，导致鼻炎的感染源也会释放更多的LPS，这些原因可能都会增加PD的发病概率。酪氨酸羟化酶（TH）是一种重要的限速酶，这种儿茶酚胺类物质可以合成多巴胺，因为PD病程进展与多巴胺含量密切相关，所以有研究[14-16]认为，TH阳性神经元的含量与PD病情呈正相关。从目前的实验结果来看，小鼠长期鼻饲LPS诱导的PD模型导致脑黑质部分TH神经元数量明显减少，早期通过“嗅三针”疗法可以阻止减少的发生，这可能也是“嗅三针”针刺疗法干预PD早期的机制之一。