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黄芩苷对复发性流产小鼠模型母胎免疫微环境的调节

2018-08-22马雁南杨小颀马晓军

长春中医药大学学报 2018年4期
关键词:母胎安胎孕酮

马雁南,杨小颀,马晓军,胥 冰,刘 洋

(1.陕西中医药大学,陕西 咸阳 712046;2.陕西中医药大学第二临床医学院,陕西 咸阳 712046;3.陕西中医药大学第二附属医院生殖科,陕西 咸阳 712046;4.中国人民解放军32144部队,陕西 渭南 714000)

复发性流产(RSA) 其发病率约占妊娠女性总数的1%~5%[1],其高发率严重影响育龄女性生殖健康及家庭和谐。黄芩具有清热安胎的作用[2-4],其主要成分之一黄芩苷的安胎效果已被证实[5-7],但其是否通过母胎界面免疫微环境调节发挥作用,进而有效制约RSA的发生,鲜见报道。本实验选用复发性流产小鼠模型[8-10],在黄芩苷干预下经ELISA测试方法分别检测子宫组织中4种细胞因子:IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10及孕酮含量变化情况,并对受孕小鼠子宫组织切片HE染色分析,旨在研究黄芩苷是否及如何通过调节子宫局部母-胎界面免疫状态来发挥安胎作用,进而制约流产的发生,从免疫学角度来探讨黄芩苷的安胎机理,为黄芩“清热安胎”理论提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 试剂及药品 黄芩苷(Baicalin),购于博奥生物医药科技有限公司;蛋白酶抑制剂(Aprotinin),Biosharp产品。小鼠INF-γ、IL-2、IL-4、IL-10、孕酮ELISA测试盒,BioSource产品。

1.1.2 仪器设备 台式高速冷冻离心机(Neofuge 13R),上海力申科学仪器有限公司。直立式超低温冰箱(MDF-382E),SANYO Electric Biomedical Co.Ltd,Janpan。酶标仪(318MC),上海三科仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验组别处理 1)模型处理:8周龄SFP级CBA/J雌鼠30只,体质量20~22 g,DBA/2雄鼠10只,BALB/C雄鼠5只,由上海西普尔必凯实验动物有限公司提供,许可证号SCXK(沪)2013-0016。常规饲养,自由采食饮水,每日光照时间12 h。经观察临床健康,适应环境1周后,雌雄鼠交换垫料,1~2 d后肉眼观察结合阴道涂片法检查雌鼠发情情况。若阴道外观红润或肿胀,开口较大,则初步判断为发情期,行阴道涂片检查确认。将发情的CBA/J雌鼠,与DBA/2雄鼠按2:1比例合笼交配,制造复发性流产模型;与BALB/C雄鼠按2:1比例合笼,制造正常妊娠模型。次晨检出阴栓者,记为孕0 d。2)药物配制:①黄芩苷液:黄芩苷10 mg,d2H2O 4 mL,配制浓度2.5 mg/mL。②苦味酸饱和水溶液:苦味酸1.5 g +蒸馏水100 mL。③Bouin’s:苦味酸饱和水溶液75 mL +甲醛25 mL。④蛋白酶抑制剂工作液:蛋白酶抑制剂2 mg溶解于甲醇 13.33 mL,得工作浓度 0.15 μg/μL。⑤ PBS:KCL 0.2 g + Na2HPO4.12H2O 1.44 g + KH2PO40.24 g,加蒸馏水800 mL溶解,调pH值7.4,定容至1 000 mL。3)模型分组:实验动物分为正常妊娠组(A组:CBA/J雌鼠与BALB/C雄鼠交配)和实验组(CBA/J雌鼠与DBA/2雄鼠交配制造的复发性流产模型),实验组随机分为模型对照组(B组)和黄芩苷治疗组(C组),每组10只。A组自孕1 d开始连续灌胃磷酸盐缓冲液0.4 mL/(d·只),共14 d。B组均自孕1 d开始连续灌胃磷酸盐缓冲液0.4 mL/(d·只),共14 d;C组自孕1 d开始连续灌胃,黄芩苷0.4 mL/(d·只),共14 d。药物剂量参考常用最佳量为实验药物剂量[11-12]。孕14 d处死所有孕鼠。4)实验取样:孕满14 d颈椎脱臼法处死孕鼠。打开腹腔,暴露子宫,观察子宫生长情况,记录胚胎着床数目和胚胎吸收数目。发育正常的子宫胚胎形状似串珠,色泽光鲜,大小均一,胚胎的中间部位可见红色条索状胎盘。而发育异常子宫呈黑紫或褐色,内可见陈旧性出血或伴血凝块,体积明显变小,部分胚胎萎缩或消失,解剖镜下观察,模糊一片无正常胚胎结构。而后在冰盒上完整取出子宫,除去系膜及脂肪组织后称重。纵向剖开子宫,完整剥离胚胎后称量子宫净重。剪下右侧子宫,称重后加入pH = 7.4的磷酸盐缓冲液(内含6倍量0.75 μg/mg的蛋白酶抑制剂),立即在低温环境中进行匀浆,4 ℃,12 000 r/min,离心15 min。取上清液分装,- 80 ℃冻存,用于ELSIA测定INF-γ、IL-2、IL-4、IL-10的含量。左侧子宫剪下后立即放入Bouin’s液中固定,然后浸入70%乙醇中,用于HE染色。

1.2.2 测定各组别相关研究因素含量 遵照试剂盒说明书操作,反应终止后,在酶标仪450 nm波长处读取吸光度(OD)值,利用已知浓度的标准样品OD绘制标准曲线,据此标准曲线计算IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10细胞因子及孕酮的含量,并在电子显微镜下观察各组别子宫组织切片HE染色差异。

1.3 统计学方法 所有数据使用Excel 2 000和SPSS 13.0软件包进行统计,单变量方差分析组间差异显著性。实验数据以均数±标准差(x± s)表示,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组流产率、胚胎吸收率比较 见表1。

表1 各组妊娠率、胚胎吸收率比较(n = 10) %

2.2 各组子宫组织中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10细胞因子含量比较

2.2.1 子宫组织中Th1型细胞分泌细胞免疫因子IFN-γ、IL-2含量比较 见表2。

2.2.2 子宫组织中Th2型细胞分泌细胞免疫因子IL-4、IL-10含量比较 见表3。

2.3 各组子宫组织中孕酮含量比较 B组中P4的含量与A组相比差异显著(P<0.05)。C组中P4的含量与A组相比差异不明显(P>0.05)。C组与B组相比差异显著(P<0.05),见表4。

表2 子宫组织中Th1型细胞分泌细胞免疫因子IFN-γ、IL-2 的含量比较(x± s ,n = 10) pg/mL

表3 子宫组织中Th2型细胞分泌细胞免疫因子IL-4、IL-10含量比较(x± s ,n = 10) pg/mL

表4 各组子宫组织中孕酮的含量比较(x± s ,n = 10) pg/mL

2.4 各组子宫大体组织及切片HE染色分析 3组子宫胚胎大体标本结果:A组子宫胚胎形状似串珠,色泽光鲜,大小均一,胚胎的中间部位可见红色条索状胎盘;B组子宫内可见陈旧性出血或伴血凝块,体积明显变小,部分胚胎萎缩或消失;C组子宫色泽红润,大小一致,胚胎发育正常。

3组HE染色结果:A组子宫腺体清晰可见,子宫蜕膜细胞排列整齐,大小均匀,数量正常;B组蜕膜细胞碎裂,数量明显减少,大量炎细胞浸润,局部难以见子宫腺体;C组蜕膜细胞明显增多,排列整齐,核增大,腺体清晰可见。3组切片HE染色表现出明显悬殊。

3 讨论

复发性流产(RSA)是妇科一种常见且多发的疾病,其高发生率和高危害性已严重影响育龄女性生殖生育健康,被社会广泛关注[11-13]。刘志兰等[14]对临床1 101例复发性流产病例研究分析后认为,RSA经典四大明确病因中,影响力从高到低依次为自身免疫异常(17.80%)、夫妻染色体异常(7.63%)、内分泌异常(5.36%)及解剖异常(3.73%)。随着现代临床检测手段的不断升级和生殖免疫研究的精准化深入,位列首位的致使RSA发生的自身免疫因素正逐步向母胎界面免疫微环境的耐受调节机制研究方面聚焦,因生理性妊娠过程依赖于母胎间免疫耐受的建立与维持,即母体免疫系统对胚胎遗传的父系抗原所产生的反应是免疫支持和防护而非攻击,而一旦这种保护性免疫机制失调,势必导致流产等现象发生。研究[15-16]证实,若母胎界面免疫微环境中攻击型Th1细胞分泌细胞免疫因子明显强于防护型Th2细胞,即打破经典Th1/Th2平衡理论,则致使胚胎丢失,亦即发生流产行为。相关研究[17]表明,如缺乏IL-4,则无Th2型反应,其流产率及胚胎吸收率也骤然上升,可见子宫局部母-胎界面免疫状态稳定对RSA的重要意义。

从本实验统计结果可发现:在黄芩苷干预治疗作用下,复发性流产小鼠模型的流产率及胚胎吸收率明显降低,安胎效果几乎与正常妊娠模型相似,充分证明黄芩苷可有效制约复发性流产的发生;同时,经ELSIA法测定受孕子宫匀浆组织中INF-γ、IL-2及IL-4、IL-10 4种免疫因子含量可见:黄芩苷作用下既明显抑制Th1型细胞分泌INF-γ、IL-2因子,又明显促进Th2型细胞分泌IL-4、IL-10因子,使得母胎界面免疫微环境的Th2型细胞因子的整体水平上调,促使Th1/Th2平衡偏向Th2型,抑制RSA发生,有力证明了黄芩苷通过调节子宫局部母-胎界面免疫状态这一机制来制约复发性流产行为;另外,黄芩苷也明显提升了子宫局部孕酮的含量水平,影响并保护蜕膜细胞及子宫腺体正常发育,为安胎提供了确凿科学依据。

本文通过科学实验不仅证明黄芩苷通过调节子宫局部母-胎界面免疫状态机制,抑制Th1型免疫细胞,促进Th2型途径发挥良好安胎作用,并能提升孕酮激素水平,有效降低RSA发生率,实验成果较明显。相信在进一步加强临床结合基础研究的将来,黄芩苷在治疗复发性流产中必会有更大突破性进展。

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