干扰素在中枢神经系统退行性疾病中的作用

向敏，舒扬，汪毅，毕明达，汪雪峰，冯玎琦，毛佳慧

（1江苏大学附属医院检验科，镇江212001；2江苏大学附属医院中心实验室，镇江212001；3江苏大学附属医院药剂科，镇江212001）

细胞因子是由免疫细胞和非免疫细胞受刺激合成并分泌的一类具有生物学活性的分子量较小的蛋白质，包括干扰素（interferons, IFNs）、白介素（interleukin, IL）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）等。其中，IFNs是最近中枢神经系统研究领域最热门的细胞因子之一。IFNs是一类调控免疫和抗病毒的多功能细胞因子。在中枢神经系统中，胶质细胞作为细胞因子的主要靶细胞，受到不同类型细胞因子的调控。以前的研究主要集中在细胞因子调控胶质细胞进而间接地影响神经元的功能，但是大量的研究表明细胞因子也可以直接作用在神经元细胞上。自从被科学家发现以来，IFNs被认为是一种独特的细胞因子，在中枢神经系统的发育、分化以及疾病发生、发展以及治疗中发挥重要的调控作用，包括阿尔兹海默病、帕金森病、多发性硬化、脑缺血等。由于IFNs功能上具有多效性以及组织上具有特异性，本文就近年来IFNs在中枢神经系统中的作用进行总结。

1 IFNs的分子结构

IFNs由Drs. Issacs和Lindenmann于1957年发现并命名，是一类维持机体正常生理功能和保护机体组织抵御外来损伤的细胞因子，具有抗病毒生长和复制功能[1]。在正常的细胞和组织内，IFNs维持相对较低的浓度[2]。浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells, pDCs）是产生IFNs的主要细胞，同时持续表达对IFNs快速合成起主要调控作用的干扰素调控因子7（IFN-regulatory factor 7, IRF7）[3-5]。

根据生物学功能和蛋白结构，INFs目前主要分为三类：I型IFN、II型IFN、III型IFN（表1）。其中，I型IFN主要由免疫调控相关细胞分泌并发挥抗感染作用，II型IFN主要由激活的T细胞分泌。III型IFN最初命名为IL-29、IL-28A、IL-28B，后来发现其生物学功能更接近IFNs，最终根据人类基因组2012 年的规定更名为 IFN-λ1、IFN-λ2 和 IFN-λ3。

2 IFNR的分子结构

IFNs发挥作用必须和细胞膜上的受体结合，不同的IFNs与相应的受体结合激活或者抑制下游基因的表达而发挥生物学功能。I型IFN受体（IFNAR）在几乎所有的体细胞细胞膜上都有表达，在结构上由不同信号传导功能的亚基AR1和AR2构成，功能上包括胞外段的配体-受体结合域和胞内段的激酶域 （IFN-β与其家族的另一个成员IFN-α拥有相同的受体）。当I型IFN与IFNAR结合后，激活IFNAR受体激酶段，引起下游一系列反应。IFN-β与IFNAR亲和力要强于IFN-α，同时在IFNAR1上有特异性的结合位点[6]。同时，在基因列阵（gene-array）研究中，IFN-β在纤维肉瘤细胞、原代血管内皮细胞、黑色素瘤细胞等细胞内对干扰素刺激因子(ISGs)的激活作用强于IFN-α[6-9]。II型IFN受体在T细胞、B细胞以及髓系细胞上高表达，同样由两个亚基构成，分别为IFNGR1和IFNGR2。其中II型IFN与IFNGR2受体结合作用力不强，却介导IFNs信号在细胞内传导。III型IFN受体主要表达在上皮细胞，包括表皮细胞、支气管上皮细胞、胃肠道上皮细胞等，主要由IFN-λR1和IL-10R2构成异二聚体复合物。最终，IFNs在细胞表面通过与不同的受体结合发挥特定的生物学功能（表1）。

表1 IFNs的分类以及组织分布Tab. 1 Classification and tissue distribution of IFNs

3 IFNs的激活和调控机制

几乎所有类型的细胞在应激反应时都可以产生IFNs，但是主要产生IFNs的细胞为树突状细胞。病原体相关的分子模式（PAMPs）通过识别病原相关分子模型受体（PRRs）包括Toll样受体（TLRs）和细胞质核酸传感器，激活干扰素调节因子（IRF）调控IFNs的表达[10]。树突状细胞产生的I型IFNs是其他类型细胞的1000倍[11]。同时，sIFNR与IFNs形成复合物直接刺激相关细胞，包括大多数的神经系统、内皮细胞、少突细胞等。一些信号相关分子MAVS、STING、TBK、IKK可以直接导致I型IFNs的分泌[12]。同时，IFNs通过调控相关通路发挥功能，包括STAT （the janus kinase1-signal transducer and activator of transcription）信号通路。IFNs结合到IFNAR并激活JAK1和Tyk2激酶，进一步激活胞浆内的STATs蛋白。激活的STATs结合到IRF9上形成复合物并入核与ISREs （IFN-stimulated regulatory elements）相互作用后调控IFNs基因的表达。

与此同时，科学家发现相关的信号通路也受到IFNs调控，例如：P38、PI-3K、NF-κB等。研究证明IFN-β与其相关受体结合引起下游一系列的免疫反应∶ ①IFN-β免疫调控主要以磷酸化Janus Kinase（JAK）的酪氨酸位点，以及信号转导与转录激活蛋白（STAT）为主，其中磷酸化的STAT1和STAT2需要乙酰转移酶P300才能发挥生物学作用，随后与P48结合形成复合物再转移到核内与ISRE结合诱导干扰素刺激基因（ISGs）的转录；② IFN-β激活mTOR,磷酸化p70 S6K和RPS6等使elF-4B磷酸化，介导某些ISGs的翻译过程；③ MAPKs是一类丝/苏氨酸蛋白激酶，包括P38、Erk和JUK。其中，IFN-β可通过诱导PKC激活MKK4，最终激活P38和JUK；④ IFN-β激活PI3K-Akt通路后，导致IKKβ磷酸化。磷酸化的IKKβ与NF-κB复合物分离并且被降解，最终NF-κB由胞浆进入胞核发挥生物学功能。

4 IFNs在神经系统中的作用

因为血脑屏障的存在，中枢神经系统普遍被人们认为是免疫豁免器官。Breder和Plata-Salaman等报道在中枢神经系统中存在大量细胞因子才打破了人们的传统观点，例如：IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-β、IFN-γ等。由于中枢神经系统（CNS）缺少pDCs，以往认为IFNs不存在于CNS。最近已有大量文献报道，在CNS中，胶质细胞（主要由小胶质细胞和星形胶质细胞等组成）和神经元同样可以合成并分泌IFNs，参与CNS的免疫调控而发挥相应的生物学功能。其中I型IFN主要在机体发挥抗病毒和免疫应答作用，但在中枢神经系统中的作用研究并不十分清楚。由于IFNs功能上具有多效性以及组织上具有特异性，其在神经系统中的作用被越来越多的学者所关注。2005年，神经元和胶质细胞被发现不但可以受到IFNs调控还可以直接分泌IFNs。其中，脑缺血后通过高度敏感的荧光定量PCR检测到IFN-β以相对较低的浓度存在于健康者的大脑中。II型IFN主要作为一种炎症因子导致大量的神经元丢失。大量的研究表明IFNs与胶质细胞的调控、神经元的存亡、神经系统退行性疾病、多发性硬化等密切相关。

4.1 IFNs与胶质细胞

在神经系统免疫调控中发挥作用的胶质细胞类型主要为小胶质细胞和星形胶质细胞，但是激活机制并不清楚。小胶质细胞被称为神经系统特异性的巨噬细胞，在细菌感染、多发性硬化、帕金森病和阿尔兹海默病中都被激活。CD40在多发性硬化、类风湿性关节炎、阿尔兹海默病中异常表达，促进疾病的发生以及恶化，并受到包括IFN-γ和LPS调控[13]。目前研究表明IFN-β可以上调CD40在巨噬细胞和小胶质细胞中表达，但是可被细胞因子功能抑制性因子（suppressor of cytokine function，SOCS-1）所逆转[14]。近来，研究表明小胶质细胞TLR激活需要外周免疫细胞（T辅助细胞或者自然杀伤性细胞）释放的IFN-γ协同作用才能最终导致神经元功能紊乱或者死亡[15]。作为一种炎症因子，IFN-γ在脊髓中通过激活小胶质细胞诱导神经疼。敲除IFN-γ减少小胶质细胞激活和磷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）氧化酶的表达以及与炎症相关酶类时间依赖性的改变，包括：一氧化氮合成酶（iNOS）、环氧化酶-2、细胞因子（白介素-1β、肿瘤坏死因子 -α）、信号因子（JNK、P38、STAT1、NF-κB、CREB、BDNF）等[16]。IFN-β 通过调控 NF-κB 参与星形胶质细胞的增殖、存活和死亡[17]。IFN-β减少星形胶质细胞凋亡机制比较复杂，而且与其浓度相关。同时，IFN-β在不同浓度下对细胞的作用可能是相反的，这也合理的解释不同研究揭示IFN作用的差异性。在脊髓中，IFN-α同样表达在星形胶质细胞上。IFN-β可以通过P38-MAPK通路激活减少TNF导致的星形胶质细胞凋亡。同时，IFNs调控星形胶质细胞分泌神经营养因子在疾病发病中保护神经元以及减少过度死亡[15,18]。当IFN-γ刺激星形胶质细胞和人星形胶质细胞系U-373MG后，收集到的上清液可以导致SH-SY5Y细胞活力降低[19]。以上结果说明，IFNs可以直接导致胶质细胞激活并影响神经元的活性。

4.2 IFNs与神经元

神经元同样是细胞因子调控的重要靶细胞，但是IFNs对神经元的作用并不是很清楚。在SH-SY5Y细胞系中，IFN-α（2-100ng/ml）会导致细胞损伤以及毒性反应。在表浅的脊髓后角神经元中，IFN-α通过减少capsaicin导致神经激肽NK-1受体内化抑制伤害性刺激的传导和磷酸化细胞外信号调节酶（ERK）。IFN-α减少脊髓疼痛并提高疼阈值，而IFN-α中和抗体导致疼觉过敏[20]。在脊髓胶状质神经元中，IFN-α通过刺激A或C传入纤维导致谷氨酸能突触后电位激发。进一步研究表明，IFN-α会导致剂量依耐性的增加自发性兴奋性和突触后电位的频率（振幅不受影响）[21]。通过使用高分辨率多角度旋转核磁共振，研究发现IFN-α2可以提高SHSY5Y细胞的代谢水平，包括肌酸、乳酸、肌醇、牛磺酸、磷酸甘油胆碱等[22]。在原代海马神经元中，IFN-β会减少P75NTR以及TrkA的蛋白表达水平以及减少TrkB蛋白表达并导致AKT蛋白磷酸化水平增强并最终减少神经元凋亡。IFN-β上调TrkC-T1负反馈调控神经营养因子3（NT3）减弱对神经元的保护作用[23]。IFNs受到单胺类化合物、谷氨酸、阿片类药物等作用改变神经传递并最终影响下丘脑-垂体-肾上腺轴[24]。在脑认知损伤的老年小鼠中，通过使用I型IFN受体中和抗体可以部分修复认知功能和海马神经元的再生，同时重建II型IFN依赖的脉络丛活性[25]。IFN-γ激活经典的信号传导通路STAT1减少Nestin+祖细胞的增殖以及循环细胞数量，但是增加神经母细胞的数量并刺激神经细胞的分化[26]。最近动物实验表明，IFN-γ导致多巴胺能神经元丢失和黑质纹状体退行性病变。α-突触核蛋白和IFN-γ水平与年龄成正相关[27]。JAK抑制剂或者基因敲除STAT1处理NPCs细胞将消除IFN-γ引起的神经形成并降低原神经基因（Neurog2）的表达水平[28]。IFN-γ基因敲除小鼠的黑质致密区（SNc）多巴胺能神经元能够抵御农药带来的副作用，减少炎症反应和氧化应激水平。

4.3 IFNs与神经系统退行性疾病

4.3.1 IFNs与帕金森病

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）主要是由于神经元胞质内路易斯小体形成，黑质纹状体脑区大量多巴胺能神经元丢失造成学习、记忆、行为功能异常的神经系统疾病。在帕金森病人尸检结果或者动物模型上都报道黑质纹状体脑区有神经炎症和细胞因子（IFNs）高表达[29,30]。IFNs被很多临床研究证实与帕金森病有关，但是IFNs是否直接导致帕金森病并不清楚。在帕金森病模型小鼠中，IFNAR1受体将缺失减少神经炎症反应对神经元的损伤作用。I型IFN可以调控Rotenone导致的神经炎症以及特殊类型的神经细胞，包括神经元和胶质细胞。在IFNAR-/-受体敲除小鼠的神经元中，Rotenone导致的神经元caspase-3激活被减弱[31]。通过IFNAR1受体中和抗体封闭I型IFN信号，可以部分恢复认知功能障碍老年小鼠的认知功能以及海马神经元再生。蛋白自噬功能异常和路易斯小体形成是帕金森病的主要病理表现。最近，研究发现IFNAR-/-受体基因敲除小鼠在出生后出现帕金森病样的行为学改变（运动协调能力、学习记忆、认知能力等相关功能障碍），并发现自噬功能障碍的神经元中并发现大量的路易斯小体形成[32]。通过MPTP刺激IFNAR1受体敲除模型小鼠或者IFNAR1中和抗体处理的模型动物均发现神经炎症反应增强以及多巴胺能神经元丢失[30]。IFNs被报道作为神经营养因子可以减少1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+)或Rotenone等毒性药物导致的多巴胺能神经元丢失[31]。同时，IFN-γ与PD的进程也直接相关。IFN-γ可以直接通过激活小胶质细胞导致多巴胺能神经元的丢失[33]。富含亮氨酸重复激酶2基因（LRRK2）被认为是PD相关基因[34]。同时，LRRK2在免疫系统中发挥重要作用并在不同的免疫相关细胞中高表达[35]。IFN-γ可以通过细胞外信号调节激酶5（ERK5）在巨噬细胞中调控LRRK2的表达[36]。同时IFN-γ在PD中调控神经细胞中LRRK2的表达将引起人们的关注。

4.3.2 IFNs与阿尔兹海默病

阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种神经元内Aβ沉积和Tau蛋白过度磷酸化，胞内神经原纤维缠结导致神经元大量丢失的神经系统退行性疾病[37]。环境因素和基因突变等因素都被证实与阿尔兹海默病发生、发展、恶化息息相关。目前，没有理想的药物延缓或者治疗阿尔兹海默病。其中，在AD病人尸检标本以及AD转基因模型小鼠的脑组织发现一系列的形炎症反应，包括：小胶质细胞激活和反应性星型角质细胞存在、炎症相关细胞因子表达上调[38]。那么，细胞因子家族中重要成员IFNs是否参与其中? 研究表明IFN-γ预处理的神经元（皮层神经元、小脑神经元、SH-SY5Y细胞）对Amyloid-β1-42刺激更敏感。同时，Amyloid-β1-42处理IFN-γ预处理的SH-SY5Y细胞导致细胞质磷脂酶A2和前列腺素E2上调最终导致阿尔兹海默病中神经元的丢失[39]。最新研究发现，可溶性Aβ1-42可以通过Tyk2-STAT信号通路激活导致神经元死亡，而Tyk2-STAT信号通路的上游调控因子IFNs和神经元凋亡以及Aβ1-42毒性相关。

4.3.3 IFNs与多发性硬化

多发性硬化是一类以白质炎性脱髓鞘为主要特点的中枢神经系统自身免疫疾病[40]。IFN-β通过调控免疫反应在临床上治疗复发性多发性硬化[41]。IFN-β处理病人的最主要的变化是神经营养因子内稳态的改变，包括脑源性神经营养因子、胶质细胞衍生神经营养因子、神经生长因子等。研究表明，IFN-β通过激活T细胞导致神经营养因子释放减少炎症反应[42]。IFN-β抑制CD25+FOXP3+阳性T细胞减少神经系统自发性免疫疾病[43]。Stefanie Scheu发现在自身免疫性脑膜炎模型中，激活的小胶质细胞是产生IFN-β的主要来源[44]。IFN-β1a通过调控STAT1信号通路减少EAE模型中线粒体毒性导致的神经元死亡[45]。在IFN-β和富马酸二甲酯联合治疗对自身免疫性脑膜炎具有协同治疗作用[46]。

4.3.4 IFNs在脑缺血中的作用

脑缺血是仅次于心脏疾病的第二大死亡诱因，目前的治疗手段并不能很好的解决临床问题，因此，探索新的治疗方案对脑缺血的诊治至关重要。在脑缺血中，内源性的IFN-β可以通过抑制中枢抗原提呈细胞（小胶质细胞和星形胶质细胞）减少反应性T细胞扩增[47]。IFN-β鼻腔给药可以通过JAK1/STAT3/BCL-2信号通路减少新生儿脑缺血中神经元的凋亡[48]。

5 总结

国内外的研究结果显示IFNs在中枢神经系统中发挥重要作用。有的结论证明IFNs与减少炎症反应相关，起到保护神经元的作用，有的结论证明IFNs与增加炎症反应水平相关，最终导致神经元丢失，那么到底那些条件下将会导致IFNs发挥不同的作用呢?对于这个问题，我们认为存在以下两方面的情况（以IFN-β为例）：一种为疾病初期，这种情况下IFN-β的浓度不高，主要调控下游通路减少胶质细胞激活导致的炎症反应、增加神经营养因子的水平以及维持神经元的内稳态；另一种为疾病末期，这种情况下大量的IFN-β由胶质细胞或者神经元释放到组织间隙、血液、脑脊液中，直接导致胶质细胞过度激活，细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）增加，神经营养因子减少，神经元丢失。目前临床上已经使用IFN-β治疗多发性硬化，减少疾病发展中的髓鞘损伤性物质的生成。总之，IFNs在生物学多效性中发挥中枢神经系统发挥重要作用，为中枢神经系统退行性疾病的预防、治疗以及减少并发症发挥重要作用。