不同负压条件对17℃保存猪精液生化指标的影响

2018-08-20李雁冰孙思怡韩淑敏魏国生李井春

中国畜牧杂志 2018年8期

李琦，李雁冰，王硕，孙思怡，韩淑敏，张帆，魏国生，李井春

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319）

伴随着我国畜牧业的蓬勃发展，猪精液的液态保存技术得到了长足的进步。目前我国规模化猪场95%以上使用液态保存精液进行人工授精，少部分使用冷冻精液[1]。虽然液态保存精液的精子活率以及母猪受胎率优于冷冻精液，但其在保存时间方面存在严重劣势[2]。现代物流业的快速发展和猪同期发情技术日渐成熟使得猪液态保存精液在全球实施人工授精逐渐成为可能[3]。我国拥有着丰富的猪品种资源有待开发，但猪精液液态保存方面的相关技术仍不成熟，其相关机理也还不清楚。

如何进一步延长猪精液液态的保存时间以及提高精液质量，成为人工授精技术研究的热点。有报道称通过负压处理可提高绵羊的精液质量和受精率[4]。此外，猪的附睾环境是低氧高渗透压，模拟猪的附睾环境有助于提高精子的质量[5]。然而关于负压对猪精子质量的影响的研究鲜有报道。本研究旨在通过检测液态17℃保存精子的活率、pH、总抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity，T-AOC）和精液中过氧化氢（H2O2）含量来评价负压对精子代谢和精子质量的影响，为猪精液常温保存的研究提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 主要试剂辣根过氧化氢酶等均购自Sigma公司。T-AOC试剂盒购自南京建成生物工程研究所。稀释液采用改良Modena溶液，4 mg/mL BSA（牛血清白蛋白，现用现配）。无菌操作台过滤，4℃保存。

1.2 猪精液的准备实验精液采自黑龙江八一农垦大学猪场20月龄健康成年长白种公猪，通过手握法收集4头长白公猪富含精子的精液30～50 mL。精液用改良的Modena溶液稀释3倍，在收集后2 h内将稀释后的样品运送到实验室。检测活率在80%以上方可使用。通过离心（750×g，5 min）洗涤1次后，将精子以1×108cells/ mL的浓度重悬于Modena稀释液，实验重复4次。

1.3 精液的保存将稀释好的精液分为4组，装于15 mL离心管中，分别装入负压保存装置。用真空浆将其压强调整至正常大气压（对照组）、负0.02 MPa（P2组）、负0.04 MPa（P4组）、负0.08 MPa（P8组）。负压装置由250 mL玻璃广口瓶、橡胶塞以及球星阀组成，橡胶塞周围涂抹凡士林以增强密封性。为减少细菌等微生物对精液品质的影响，所有操作需在无菌操作台进行，每24 h测定精子活率、pH、T-AOC、H2O2含量等指标，每次测定取1 mL样品，剩余样品装回负压保存装置之后用真空泵抽负压（真空泵上接有压力表以显示负压值）。之后置于17℃恒温箱中保存，当精子活率低于20%时，实验结束。

1.4 精子指标的检测

1.4.1 精子活率及pH检测根据实验设计，每24 h取出1 mL精液，使用迈朗全自动精子分析仪检查精子活率，做好实验记录。利用酸度仪分别检测原精液、稀释液以及稀释后精液的pH。每天检测1次，观察其变化规律。

1.4.2 T-AOC活性测定操作按照南京建成生物工程研究所总抗氧化能力试剂盒进行，检测方法根据试剂盒说明书测定。分别在保存的0、1 d测定，之后每48 h测定各组精子的T-AOC。

1.4.3 精液H2O2含量测定将精液1 800 r/min离心，取上清液20 μL，用蒸馏水稀释到1 mL，加入0.8 mg/mL的HRP 0.75 mL，0.8 mg/mL的苯酚红0.45 mL，0.8 mL PBS，室温 5 min后，加入 40 μL 3 mol/L 的 NaOH，610 nm处测吸光度OD，根据标准曲线得出培养液中H2O2浓度。分别在保存的0、1 d测定，之后每48 h测定不同组培养液中H2O2的浓度。

1.5 统计分析利用StatView 5.0软件对实验测定的各项指标进行方差分析和多重比较分析，实验结果以平均值±标准差来表示，P＜0.05为差异显著。实验数据重复数为4次。

2 结果

2.1 不同负压对17℃保存猪精子活率的影响由表1可知，随着保存时间的延长，各组精子活率逐渐下降。相对实验组而言，5 d后对照组猪精子活率下降速度最快（P＜0.05），负压条件下有利于猪精液的保存。P2、P4组在保存时间为5～11 d时的精子活率显著高于对照组（P＜0.05）；到13 d时P4组精子活率显著高于其他组（P＜0.05）。

表1 不同负压对17℃保存猪精子活率的影响

2.2 不同负压对17℃保存猪精子pH的影响由表2可知，随着保存天数的延长，猪精液的pH逐渐下降。P4和P8组精液的pH从保存第7天开始，均显著高于对照组（P＜0.05）；第13天时各实验组pH均显著高于对照组（P＜0.05）；而7 d后各实验组的pH差异均不显著（P＞0.05）。

2.3 不同负压对17℃保存猪精子T-AOC活性影响由表3可知，各组精子的T-AOC活性随保存时间的延长而降低。在保存第5天之前，对照组的精子T-AOC活性与P2组无显著差异（P＞0.05）；在3～9 d时P4、P8组T-AOC显著高于其他2组（P＜0.05）。不同负压处理组（P4组与P8组）比对照组表现出更高的抗氧化能力。因此，适当的负压有助于维持公猪精子的抗氧化能力。

表2 不同负压对17℃保存猪精液pH的影响

表3 不同负压对17℃保存猪精子的T-AOC的影响

2.4 不同负压对17℃保存精液中H2O2含量的影响由表4可知，随着保存时间的延长，各组精液中H2O2含量逐渐上升；保存1 d时4组精液中H2O2含量无显著差异（P＞0.05）。保存5～13 d，对照组精液中H2O2含量显著高于3个负压处理组（P＜0.05），P4和P8组之间没有显著差异（P＞0.05）。

表4 不同负压对17℃保存精液中 H2O2 含量的影响 μmol/L

3 讨论

3.1 不同负压对17℃保存猪精子活率的影响精子活率是评测精子质量的重要指标之一，精子活率的高低直接影响着受孕率的高低[6]。精液pH可间接反映精子活率的好坏。Casali等[4]研究发现，通过负压处理可提高绵羊精液质量和受精率。在猪的附睾中猪精子长期处于一种低氧高渗透压的环境，使得猪精子处于一种半休眠状态，新陈代谢较低[7]。在进行猪的人工授精时要求猪精液的活率应不低于60%。从本实验结果可以发现，处于负压状态下的猪精液其精子活率优于常压环境，以精子活率不低于60%标准，负0.04 Mpa和负0.08 Mpa条件下的精子活率要优于常压条件，所以应用适宜的负压能提高精子活率。

3.2 不同负压对17℃保存猪精子pH的影响包宋权等[8]发现，在猪精液的保存过程中不可避免地会受到细菌以及自身新陈代谢的影响，从而导致猪精液的质量和pH下降。许多研究表明，长期保存公猪精子需要降低其代谢活性，这主要通过适当的稀释剂稀释以及将温度降至15～17℃来实现[9]。本实验中在负压保存的猪精液pH要优于常压，这可能是负压环境会导致精子的新陈代谢降低，将在下一步的实验中予以探究。普遍认为在猪精液的保存过程中，猪精液pH是先降低后升高最后趋于稳定[11]。本实验中，猪精液pH不管是常压下还是负压下都一直在下降，这可能与检测时间以及实验操作有关，将需进一步探究。本实验中，在负压保存下的猪精液pH下降程度要优于常压，与Casali等[4]通过负压处理提高了绵羊精液质量基本一致，但其作用机理还有待进一步的探究。

3.3 不同负压对17℃保存猪精子T-AOC活性及精液中H2O2含量影响氧化应激被认为是导致精液质量变差的最重要的因素之一[12]，T-AOC是反映精子抗氧化能力指标之一。在本实验中，负压处理组较对照组表现出更高的抗氧化能力。在精液保存过程中，精液中活性氧（ROS）的产生会导致精子细胞成分的氧化损伤，即超氧阴离子自由基（O2-）、H2O2和脂质过氧化物，这是精子质量下降的主要原因[13]。为了减少ROS在保存精液中对精子质量的有害作用，通常需要在精液中添加抗氧化剂[14]。本实验中，适宜的负压能降低精液中H2O2的含量，这与添加抗氧化剂的作用相同，并且适当的负压可以通过降低精子代谢产生H2O2来改善精子的活率。在后续研究中，将在适当的负压条件下添加抗氧化剂以进一步改善公猪精液保存质量。